Presentació d'autoantígens per MHC II en cèl·lules endocrines: anàlisi del repertori de pèptids associat a DR4 i de la influència de les chaperones li i HLA-DM

Abstract

Les molècules MHC de classe II uneixen pèptids generats en l'interior de la cèl.lula i els presenten a les cèl.lules T CD4+, que inicien i regulen la resposta immunitària. Les cadenes a i b que formen les MHC de classe II de nova síntesi, interaccionen amb una chaperona, la cadena invariant (Ii), que estabilitza el plegament dels dímers ab i impedeix la seva unió als pèptids presents en el reticle endoplasmàtic (RE). La interacció amb Ii també permet l'arribada dels complexes MHC II-Ii a la via endocítica on la chaperona es degrada fins que només el segment anomenat CLIP roman unit al solc d'unió a antigen dels dímers ab. L'alliberació del CLIP i la unió amb pèptids antigènics s' afavoreix pel baix pH dels endosomes i és catalitzada per HLA-DM, que estabilitza les MHC II i selecciona els pèptids units més estables. Quan s'ha format el complex MHC II-pèptid, aquest és conduït cap a la superfície cel.lular. En les cèl.lules B s'ha descrit l'expressió de la co-chaperona HLA-DO que interacciona amb el complex MHC II/DM i modula l'acció d'HLA-DM. <br/>En les malalties autoimmunitàries específiques d'òrgan, com la diabetis de tipus 1, la resposta autorreactiva destrueix selectivament les cèl.lules epitelials endocrines. En aquestes situacions s'ha descrit l'expressió de MHC II així com l'expressió variable de la cadena invariant (Ii) i HLA-DM, suggerint que la presentació d'epítops críptics per les cèl.lules endocrines podria permetre el manteniment de la resposta autorreactiva. En aquest treball s'ha estudiat aquesta hipòtesi des de dos aproximacions: (i) l'anàlisi del repertori peptídic associat a les MHC II en cèl.lules endocrines mitjançant tècniques d'espectrometria de masses i (ii) la caracterització de la via endocítica on s'associen els lligands a MHC II, per tècniques de microscopia electrònica de transmissió. L'estudi s'ha realitzat sobre el model experimental aconseguit per transfecció estable de la línia cel.lular derivada d'un insulinoma de rata RINm5F, amb els gens de les molècules humanes: HLA-DRB1*0401, Ii i HLA-DM. La transfecció seqüencial dels diferents gens permeté obtenir les cèl.lules endocrines (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, i (iv) RIN-DR4IiDM. Els resultats mostren que les cèl.lules endocrines reorganitzen la via endocítica amb l'expressió de DR4, Ii i DM, afavorint-se la formació d'endosomes tardans multivesiculars i multilaminars, on es concentren les tres molècules implicades en la presentació d'antigen. En absència de chaperones, els complexes DR4-pèptid de la superfície cel.lular es troben associats a un repertori peptídic inestable i molt heterogeni, on s'identifiquen lligands derivats majoritàriament d' extrems N- i C-terminals de proteïnes citosòliques i que en molts casos no respecten el motiu d'anclatge a DR4. La coexpressió d'Ii permet la detecció d'un major nombre de dímers DR4 fora del RE que es localitzen preferentment a la superfície cel.lular. En absència d'HLA-DM, aquests complexes són inestables i es troben associats a CLIP, tot i que també s'han identificat lligands derivats de proteïnes exògenes i autòlogues. L'expressió d' HLA-DM en absència d'Ii permet la detecció de complexes DR4-pèptid estables amb lligands que respecten el motiu d'anclatge i deriven de proteïnes de membrana i citoplasmàtiques. La màxima eficiència s'aconsegueix amb la coexpressió d'ambdues chaperones. En les cèl.lules DR4IiDM, els dímers DR4 expressats a la superfície són estables i s'associen a un repertori peptídic homogeni en seqüència, longitud i origen, format per lligands autòlegs derivats de proteïnes de la superfície, de la vía secretora i del citoplasma, en algunes ocasions específiques de llinatge. Aquests lligands sempre respecten el motiu d'anclatge a DR4 i difereixen dels identificats en una línia B limfoblastoid homozigota per DR4. Per tant, l'expressió de DR4, Ii i DM en cèl.lules endocrines permet la presentació de pèptids autòlegs, específics de teixit i amb característiques diferents als presentats per cèl.lules amb l'expressió de MHC II constitutiva. Aquests epítops a més de ser condicionats pel llinatge cel.lular, estan influenciats per l'expressió de chaperones i podrien variar durant la resposta autoimmune en l'òrgan diana, condicionant el seu desenvolupament.

MHC class II molecules present peptides to CD4+T cells to iniciate and regulate the immune response. Newly synthetized MHC class II a and b chains interact with a chaperone named invariant chain (Ii) that stabilizes their folding preventing the binding of peptide ligands in the endoplasmic reticulum (ER). The invariant chain targets MHC II-Ii complexes to the endocytic pathway where it is proteolitically degraded leaving a portion of its sequence named CLIP bound to the ab dimers. The exchange of CLIP for stably bound peptides is favoured by the endosomal acidic pH and catalized by another specific chaperone, HLA-DM. Stable MHC II-peptide complexes reach the plasma membrane by vesicular transport. HLA-DO is a third class II chaperone expressed by some antigen presenting cells, like B cells, that modulate HLA-DM function. <br/>In organ-specific autoimmune diseases such as type 1 diabetes, epithelial endocrine cells are the specific targets of the autoreactive response. In these situations endocrine cells express MHC II molecules and both chaperones Ii and DM with heterogeneous expression levels that leads to the suggestion that criptic epitopes may be presented by endocrine epithelial cells, thus maintaining the autoreactive response. This hypotesis has ben approached in this work from two different points: (i) analysis of the peptide repertoire associated to MHC II by mass spectrometry techniques and (ii) characterization of the endocytic pathway, where ligands associate to class II molecules, by cryoelectron microscopy. The study has been performed using an experimental model based on the stable transfection of the rat insulinoma cell line RINm5F with human class II genes HLA-DRB1*0401, Invariant chain and HLA-DM. Sequential transfection allowed the generation of four endocrine cell lines expressing (i) RIN-DR4, (ii) RIN-DR4Ii, (iii) RIN-DR4DM, (iv) RIN-DR4IiDM. The data show that class II expression in endocrine cells induce a reorganization of the endocytic pathway, favouring the formation of multivesicular and multilaminar late endosomes where molecules involved in class II antigen presentation are accumulated. In the absence of chaperones, DR4-peptide complexes contain a highly heterogeneous unstable peptide pool, with ligands mostly derived from the N- and C-termini of cytosolic proteins, that in many cases did not respect the DR4-peptide binding motif. Ii expression increase the presence of DR4 dimers outside the ER, mostly accumulated at the cell surface. In the absence of DM, these complexes are unstable and most of them associate to CLIP, although minor ligands from exogenous and autologous proteins are also identified. DM expresion in the absence of Ii allow the detection of stably bound DR4-peptide complexes at the cell surface, containing sequences derived from either cell surface or cytoplasmic proteins. In DR4IiDM cells, DR4 complexes at the cell surafce are stable and are associated to a peptide repertoire highly homogeneous in sequence, length and origin, formed by ligands derived from surface, secreted and cytoplasmic proteins, some of them tissue-specific. All the identified ligands respect the DR4-peptide binding motif and are different from the repertoire identified in a DR4-homozygous B-lymphoblastoid cell line. Thus, DR4, Ii and DM expression in endocrine epithelial cells allow the presentation of a panel of peptides, different from the ones presented by cells with constitutive class II expression, some of which are tissue specific. This repertoire is cell type dependent and influenced by the expression of both chaperones, suggesting the possibility of variations in the target organs during the autoimmune process that may condition its development.