Caracterització genètica de la leucèmia mieloide aguda mitjançant tècniques de citogenètica i biologia molecular

Abstract

Mitjançant les tècniques de hibridació in situ fluorescent (FISH) i de hibridació in situ fluorescent multiple (M-FISH) es van estudiar diferents sèries de pacients de leucèmia mieloide aguda (LMA) en el moment del seu diagnòstic, per tal d'identificar possibles alteracions genètiques, no observades prèviament per anàlisi citogenètica convencional (ACC). Així, al analitzar dos pacients que presentaven un material cromosòmic afegit al cariotip, es va detectar en ambdós casos, una trisomia parcial del cromosoma 11, la qual es produïa per una translocació desequilibrada de la regió 11q22~23 a 11qter. Aquesta alteració cromosòmica seria una nova anomalia recurrent associada a la duplicació parcial en tàndem del gen MLL. Alhora, en la sèrie de 40 pacients de LMA amb inv(16)(p13q22)/t(6;16)(p13;q22) s'han identificat mitjançant FISH dos casos de translocacions emmascarades associades a la inv(16)(p13q22), no descrites prèviament, t(10;16)(p13;q22)inv(16)(p13q22) i t(1;16)(p36;q22)inv(16)(p13q22). Pel què fa a la sèrie de 40 pacients de LMA amb cariotip normal estudiada, no s'ha identificat per FISH la prescència de la t(5;11)(q35;p15.5) a diferència de les sèries de LMA pediàtriques publicades recentment. <br/>La tècnica de hibridació genòmica comparada (CGH) es va utilitzar per la detecció de guanys i pèrdues de material genètic en la LMA, demostrant que l'alteració genètica desequilibrada més freqüent és la pèrdua parcial de regions cromosòmiques (54 %), les quals es loalitzen majoritàriament als cromosomes 5q, 7q, 7, 16q i 17p, essent també recurrents els guanys dels cromosomes 8 i 22. Els resultats de CGH van aportar informació útil per la identificació d'alteracions genètiques no identificades prèviament per ACC, identificant alteracions cromosòmiques més complexes, i ajudant a la caracterització de cromosomes marcadors, derivatius i materials cromosòmics afegits al cariotip. Els estudis complementàris de FISH i M-FISH van confirmar els perfils de CGH i van ajudar a proposar el cariotip final, sobretot en els casos de cariotip complex. Destacar que els resultats de CGH i M-FISH suggereixen que el subgrup de LMA <60 anys i cariotip normal, no es caracteritza per la presència significativa d'anomalies genètiques.<br/>Es van estudiar perfils d'expressió gènica, mitjançant cADN array, de gens relacionats amb el mecanisme d'apoptosis en pacients de LMA, ja que alteracions en l'apoptosis tenen efecte onogènic i poden donar resistència al tractament. Un total de 27 gens apoptòtics es trobaven desregulats, dels 205 gens inclosos en l'array. Es destaquen IGFBP3, IGFBP5, CLU, GADD45 i gens codificants per enzims de detoxificació per glutatió, com a nous gens implcats en l'alteració de les vies senyalització de l'apoptosis en LMA. Els resultats es van validar per QRT-PCR a temps real, obtenint una elevada correlació entre ambdues tècniques.<br/>La mateixa tècnica de QRT-PCR a temps real es va emprar per analitzar l'expressió dels gens HOXA9, DEK, CBL i CSF1R en una sèrie de 41 pacients de LMA. La desregulació d'aquests gens s'havia s'havia identificat en treballs publicats recentment per cADN array, on se suggeria que podrien ser gens importants pel desenvolupament de la LMA. En la sèrie estudiada es va confirmar la desregulació d'aquests gens, demostrant alhora diferents associacions significatives entre expressió gènica i paràmetres biològics: sotaexpressió de HOXA9 en LMA amb t(8;21)(q22;q22); sobreexpressió de DEK i HOXA9 en LMA sense expressió de CD34; sotaexpressió de CSF1R i HOXA9 en LMA-M2; sobreexpressió de CBL i CSF1R en LMA-M5 i sotaexpressió de CBL i pacients majors de 60 anys.

To identify genetic alterations not previously detected by conventional cytogenetic analysis (CCA), fluorescent in situ hybridization (FISH) and fluorescent in situ hybridization multiplex (M-FISH) were used to analyze several series of acute myeloid leukemia (AML) at the time of diagnosis. In 2 cases whose karyotype showed an unknown additional chromosomal material, we detected a partial trisomy of chromosome 11, from 11q22~23 to 11qter, as a result of an unbalanced chromosomal translocation. Partial tandem duplication of MLL gene were detected in both cases. Furthermore, in a series of 40 AML patients with inv(16)(p13q22)/t(6;16)(p13;q22), we identify two cases of masked translocation associated with inv(16)(p13q22), which were not described previously, t(10;16)(p13;q22)inv(16)(p13q22) and t(1;16)(p36;q22)inv(16)(p13q22). Moreover, we did not detected the t(5;11)(q35;p15.5) by FISH in a series of 40 AML patients with normal karyotype, which is in contrast with previously reported series of childhood AML patients. <br/>Comparative genomic hybridization (CGH) was used to detect gains and losses of chromosomal material in a series of 128 AML patients. The most frequent genetic alteration was the partial loss (54 %), frequently involving the 5q, 7q, 7, 16q and 17p chromosomal regions. Gains of chromosome 8 and 22 were also recurrent. CGH was useful to identify chromosomal alterations not previously detected by CCA, and it help to characterize marker chromosomes, derivative chromosomes and unknown additional chromosomal materials. Complementary FISH and M-FISH experiments confirmed CGH results and helped to proposed the final karyotype. Genetic alterations were not identify by using CGH and M-FISH in the series of AML patients younger then 60 years and normal karyotype.<br/>We investigated apoptotic gene expression profiles by cDNA array technique in a series of AML patients. Alterations in the apoptotic signaling pathways have oncogenic effect and could induce resistance to therapy. A total of 27/205 apoptotic genes presented an abnormal expression as compared to the reference. IGFBP3, IGFBP5, CLU, GADD45 and several genes of glutathione detoxification pathway were identified as new important genes in the pathogenesis of AML. Real time QRT-PCR was used to confirm the data obtained by cDNA array technique, which showed a good correlation.<br/>Real time QRT-PCR were also used to analyzed in a series of 41 AML patients the expression of HOXA9, DEK, CBL and CSF1R, which were reported to be aberrantly expressed in AML. We confirm the deregulation of these genes in AML as well as we described several associations between gene expression and hematological and clinical parameters: under-expression of HOXA9 in AML with t(8;21)(q22;q22); over-expression of DEK and HOXA9 in AML without CD34; under-expression of CSF1R and HOXA9 in AML-M2; over-expression of CBL and CSF1R in AML-M5; under-expression of CBL and patients older than 60 years.