Estudi citogenètic i molecular del procés de translocacions recíproques equilibrades

Abstract

Les anomalies cromosòmiques numèriques i estructurals, són sovint causa d'infertilitat. Es conegut el fet que els homes portadors de translocacions recíproques equilibrades presenten un increment en la incidència de pèrdues embrionàries i de descendència afectada. La característica principal de l'espermatogènesi d'aquests pacients és la presència d'un tetravalente que permet l'aparellament a paquité dels cromosomes reorganitzats amb els seus homòlegs. La configuració del tetravalent determina el seu comportament i, conseqüentment, la producció de diferents proporcions de gàmetes equilibrades i desequilibrades. La seva estructura està condicionada pels fenòmens de recombinació. Diferents factores poden alterar la freqüència de recombinacions dins el tetravalente, com per exemple la morfologia dels cromosomes implicats i la llargada dels segments intersticials i translocats. Els cromosomes translocats poden segregar seguint quatre patrons diferents: alternant, adjacent I, adjacent II i 3:1. El fenotip alternant és el més freqüent, i també és l'únic que pot donar lloc a descendència normal. Cal remarcar que, en el cas que ocorri una recombinació intersticial, el fenotip alternant també pot produir-se a partir de la segregació adjacent I.<br/>En aquest treball, hem analitzat mostres d'esperma i/o biòpsies testiculars en cinc pacients portadors de les següents translocacions: t(4;8)(q28;p23), t(1;13)(q41;q22), t(3;19)(p21;p13.3) t(11;17)(q13.1;p11.2) i t(10;14)(q24;q32). L'ús de tècniques d'hibridació in situ fluorescent (FISH) ha permès establir els percentatges de gàmetes equilibrades i desequilibrades per a cada un dels pacients. Els resultats obtinguts oscil·len entre 30.5% i 44.3% per a les formes equilibrades, i entre 55.7% i 69.5% per a les desequilibrades. La segregació meiòtica del portador de la t(4;8)(q28;p23) es va determinar a partir de dues metodologies diferents, el sistema hàmster-humà i la tècnica de nuclis d'espermatozoide descondensats. La comparació dels resultats obtinguts no mostrà diferències significatives entre el total de gàmetes equilibrades i desequilibrades. No obstant, les freqüències de la segregació 3:1 obtingudes en els dos anàlisis sí foren significativament diferents (p<0.0001). Aquesta diferència es podria explicar per factors limitants de cada una de les tècniques (una mala eficiència d'hibridació o una descondensació excesiva del DNA poden donar lloc a guanys o pèrdues aparents de senyals fluorescents).<br/>L'ús de FISH sobre nuclis descondensats també permet la detecció de possibles efectes intercromosòmics (ICE). Els resultats obtinguts en l'anàlisi realitzat en els cinc pacients no evidencia la presència d'ICE, excepte en el portador de la t(4;8).<br/>L'aplicació de FISH sobre cromosomes meiòtics dels portadors t(11;17) i t(10;14) ha permès la identificació dels cromosomes translocats en estadi de MI i MII. Així, s'han obtingut dades relatives a la configuració del tetravalent, a la distribució de les recombinacions en el tetravalent i a la segregació dels cromosomes. Els resultats obtinguts mostren una disminució en el nombre de recombinacions per cèl·lula en la t(11;17) (p=0.001). En la t(10;14), la freqüència de recombinació en el segment intersticial és major que l'observada en bivalents controls dels cromosomes 10 i 14. També s'ha analitzat el comportament dels cromosomes sexuals al llarg del procés meiòtic. La incidència de les anomalies sexuals disminueix a mesura que avança l'espermatogènesi. <br/>Resumint, els nostres resultats suggereixen que el bloqueig meiòtic estaria més condicionat per la presència d'univalents que per la presència de desequilibris cromosòmics originats durant la segregació del tetravalent. <br/>Finalment, hem aplicat la tècnica de cenM-FISH sobre extensions de complexes sinaptonemals, prèviament detectades mitjançant immunocitogenètica, identificant cada un dels bivalents en el 92% de les cèl·lules analitzades (n=60). Posteriorment, els bivalents es poden cariotipar en estadi de paquitè. La tècnica de cenM-FISH pot ser molt útil per a la caracterització simultània de tots els bivalents en paquitè.

As it is well known, chromosome aberrations are a major cause of infertility. Moreover, male heterozygous carriers of reciprocal translocation have an increased risk of pregnancy loss and the birth of handicapped progeny. The main particularity of the spermatogenesis in human male translocation carriers is the way the translocated chromosomes found to associate themselves during the meiosis I. This structure is known as quadrivalent. The configuration of the quadrivalent determines the behaviour of this structure, and consequently the production of different proportions of balanced and unbalanced gametes. The quadrivalent structure's configuration is strongly defined by the formation of crossing-over. Different factors can affect the likelihood of crossing-over within the quadrivalent: the morphology of the chromosomes involved and the length of the interstitial and translocated segments are some of them. Translocated chromosomes segregate following one of the four possible segregation modes: alternate, adjacent I, adjacent II and 3:1. The predominant forms of segregation are alternate and adjacent I. Alternate phenotype is the most common found in many of the translocations studied and it is also the only phenotype that yields normal offspring. It is important to observe that if an interstitial chiasma occurs, alternate phenotypes may also be generated by an adjacent I segregation, and vice versa. <br/>In this study, meiotic analysis has been performed by either sperm data (human-hamster system or decondensed sperm nuclei) or testicular biopsy analysis in five different translocation carriers, t(4;8)(q28;p23), t(1;13)(q41;q22), t(3;19)(p21;p13.3) t(11;17)(q13.1;p11.2) and t(10;14)(q24;q32) . Using fluorescence in situ hybridisation techniques (FISH), percentages of balanced and unbalanced spermatozoa have been established for each carrier. The results obtained range between 30.5% and 44.3% for balanced and 55.7% and 69.5% for unbalanced gametes. Part of this work was the determination of meiotic segregation of a t(4;8)(q28;p23) carrier by two different methods, human-hamster system and sperm nuclei. Comparison made between the results obtained in the two analyses showed a lack of statistical differences between the total of balanced versus unbalanced forms. However, a statistically significant difference was found between the frequencies of 3:1 segregants obtained from the two methods (p<0.0001). Technical artefacts could explain this discrepancy (overlapping of signals in the sperm nuclei assay, unequal hybridisation efficiency of the used probes or even an over decondensation of the DNA can lead to apparent gains of fluorescent signals). FISH on decondensed sperm nuclei also allows for the detection of interchromosomal effects. Results obtained in the aneuploidy analysis performed on all five subjects have not shown any evidence for an interchromosomal effect, except for t(4;8) carrier.<br/>FISH has also been applied on meiotic chromosome spreads to identify translocated chromosomes in two different translocation carriers, t(11;17) and t(10;14). In doing so, data about pairing of homologous chromosomes, configurations of the quadrivalent, crossing-over distributions within a tetravalent, and segregation pattern frequencies have been obtained. Results obtained have shown a significant decrease in the chiasma frequency per cell in t(11;17) (p=0.001). In t(10;14), the recombination frequency within the interstitial segment of the quadrivalent is higher than the observed in control bivalents of chromosomes 10 and 14. The behaviour of sex chromosomes throughout meiotic process has been analysed. The incidence of sex anomalies decreased progressively in subsequent spermatogenic stages. Our results suggest that meiotic arrest processes would be more conditioned by the presence of univalents rather than by chromosomal unbalances. <br/>Finally, cenM-FISH has been applied on synaptonemal complexes spreads previously analysed using immunocytogenetic technique, allowing us to unequivocally identify all chromosomes in 92% of the studied cells (n=60). Then, bivalents can be karyotyped at pachytene stage. CenM-FISH can be a very useful tool for the simultaneous characterization of all pachytene chromosomes.