Role of Interstitial Cells of Cajal in the Pacemaker Activity and Neurotransmission in the Rat Colon

Abstract

Els objectius d'aquesta tesi han estat l'estudi de la funció de les cèl·lules intersticials de Cajal (ICCs) en l'activitat marcapassos i en la transmissió neuromuscular, dins el tracte gastrointestinal. L'estudi s'ha realitzat en el còlon perquè en aquesta part del tracte gastrointestinal els mecanismes marcapassos i de neurotransmissió són poc coneguts. El model de rata s'ha utilitzat perquè estudis previs, realitzats al nostre laboratori, van mostrar-hi un marcapassos d'origen miogènic, també descrit en el còlon humà. A més a més, les rates Ws/Ws tenen una mutació en el gen c-kit i presenten una afectació de certes línies cel·lulars, incloses les ICCs. Per tant, hem utilitzat tres grups d'animals: rates Sprague-Dawley, mutants Ws/Ws i les seves germanes controls +/+. Per investigar l'activitat marcapassos i la neurotransmissió vam realitzar: (i) tincions immunohistoquímiques amb anticossos c-kit i nNOS per marcar ICCs i neurones nitrèrgiques, respectivament; (ii) experiments d'activitat mecànica en bany d'òrgans; (iii) enregistraments elèctrics amb la tècnica de microelèctrodes intracel·lulars. <br/>Els nostres estudis mostren dues xarxes d'ICCs en el còlon de rata, a nivell dels plexes d'Auerbach (ICC-AP, 100 cèl·lules/mm2) i submuscular (ICC-SMP, <br/>50-60 cèl·lules/mm2). Les ICCs intramurals (ICC-IM) van trobar-se distribuïdes de forma paral·lela entre les cèl·lules musculars llises. Resultats similars van ser obtinguts en rates Sprague-Dawley i +/+. En canvi, les rates mutants Ws/Ws van presentar una marcada disminució d'immunoreactivitat al c-kit. Les rates Sprague-Dawley van presentar una activitat elèctrica espontània formada per ones lentes i despolaritzacions cícliques, seguint un patró regular. Aquesta activitat elèctrica dóna lloc a contraccions d'alta i baixa freqüència, respectivament. Les contraccions d'alta i baixa freqüència varien en relació a l'orientació de la tira de múscul (orientació circular o longitudinal) i també en relació al segment estudiat (còlon proximal, mig i distal). L'activitat elèctrica i mecànica de les rates +/+ va ser similar a la presentada per les rates Sprague-Dawley. Les rates Ws/Ws, en canvi, van mostrar una alteració dels patrons mecànic i elèctric, presentant potencials d'acció irregulars que donaven lloc a contraccions incoordinades. <br/>La neurotransmissió va ser estudiada mitjançant: i) la distribució i quantificació de les neurones nNOS; ii) el potencial post unió inhibitori (IJP) i la relaxació mecànica induïda per l'estimulació elèctrica de camp; iii) la presència d'un to neural. Les neurones nNOS positives es van trobar a la regió del plexe d'Auerbach formant una xarxa de ganglis i branques, acompanyades per fibres primes que van trobar-se paral·leles a les cèl·lules llises musculars ( en major nombre en la capa muscular circular). El còlon mig va ser la zona més inervada (130 cèl·lules/mm2). En les rates Ws/Ws, es va observar una lleugera reducció en el nombre de neurones nitrèrgiques. Tant en rates Sprague-Dawley, com Ws/Ws i +/+, l'estimulació elèctrica de camp va causar un IJP i relaxació mecànica, degut a l'alliberació d'ATP i NO. A més a més, es va evidenciar un to neural funcional (inhibitori), provocat per l'alliberació tònica d'ATP i NO. <br/>Per tant, podem concloure que: (i) la presència de dues xarxes d'ICCs és un element indispensable per la correcta funció marcapassos en el còlon; (ii) les ICC-SMP serien responsables de les ones lentes de les quals s'originen les contraccions d'alta freqüència; (iii) les ICC-AP serien l'origen de les despolaritzacions cícliques que provoquen les contraccions de baixa freqüència; (iv) les propietats mecàniques de cada tira serien les responsables dels patrons motors que asseguren el trànsit, propulsió i barreja.; i finalment (v) les ICCs c-kit positives són elements no essencials per la neurotransmissió a no ser que aquesta funció la pogués acomplir les cèl·lules intersticials c-kit negatives o bé que es produís un canvi del fenotip en les rates mutants Ws/Ws.

The objective of this research project was to investigate the role of interstitial cells of Cajal (ICCs) as pacemaker cells and as mediators of neuromuscular transmission in the gastrointestinal tract. We have studied the rat colon because in this part of the gastrointestinal tract the pacemaker and neurotransmission mechanisms are poorly understood. The rat is used as the animal model because previous work from our laboratory showed that a myogenic pacemaker is present, similarly to what it has been described in the human colon. Moreover, rats with a mutation in the c-kit gene show impairment of the development of certain classes of cell lineages, including ICCs. Accordingly, we have used three groups of animals: (i) Sprague-Dawley; (ii) Ws/Ws mutant rats and (iii) +/+ rats (the siblings of Ws/Ws mutant rats). To study the pacemaker activity and neurotransmission we have performed: (i) immunohistochemical stainings with c-kit and neuronal nitric oxide synthase (nNOS) antibodies to label ICCs and nitrergic neurons respectively; (ii) mechanical experiments with muscle bath technique and (iii) intracellular electrical recordings with microelectrode technique. <br/>Our results demonstrate that ICCs are present in the rat colon forming two networks at the level of the Auerbach's (ICC-AP, around 100 cells/mm2) and submuscular plexuses (ICC-SMP, about 50-60 cells/mm2). Intramural ICCs (ICC-IM) were found running parallel and between smooth muscle cells. Similar results were obtained both in Sprague-Dawley and +/+ rats. In contrast, a strong reduction in c-kit immunoreactivity was found in Ws/Ws rats. The spontaneous electrical activity in Sprague-Dawley rats consisted of slow waves superimposed with cyclic depolarizations forming a regular pattern. These two electrical events were responsible for high frequency (HF) and low frequency (LF) contractions, respectively. HF and LF contractions varied in relation to the orientation of the muscle strip (circular or longitudinal orientation) and the segment studied (proximal, mid and distal colon). The electrical and mechanical activities found in +/+ rats were very similar to those described in Sprague-Dawley rats. In contrast, Ws/Ws rats showed an impairment of the electrical and mechanical patterns, characterized by irregular action potentials, which cause uncoordinated contractions. <br/>Neurotransmission was studied with by: (i) the distribution and quantification of nNOS positive neurons; (ii) the inhibitory junction potential (IJP) and mechanical relaxation induced by electrical field stimulation and (iii) the presence of a neural tone. nNOS positive neurons were found at the Auerbach's plexus (AP) region forming a network of nerve strands and ganglia. Moreover, fine fibers were found running parallel to smooth muscle cells, especially in the circular muscle layer. The mid colon was the most innervated segment (about 130 cells/mm2). A slight reduction in nNOS positive neurons was observed in Ws/Ws rats compared to control rats. <br/>Electrical field stimulation caused an IJP and mechanical relaxation due to the release of ATP and NO. Moreover, a functional neural tone due to the ongoing release of ATP and NO was present. These results were observed in the three groups of animals: Sprague-Dawley, +/+ and Ws/Ws rats. <br/>We conclude that: (i) the presence of two ICC networks is a crucial element responsible for the pacemaker activity in the colon; (ii) the ICC-SMP network is probably responsible for the slow wave activity that originates HF contractions; (iii) the ICC-AP network might be responsible for the cyclic depolarizations that trigger LF contractions; (iv) the mechanical properties of each strip are responsible for the motor events that ensure transit, propulsion and mixing and (v) c-kit positive ICC cells are not essential elements for neurotransmission, unless this function could be accomplished by c-kit negative interstitial cells or alternatively, a change in the phenotype of Ws/Ws animals occurs.