Estudi de la sinapsi i de la recombinació meiòtica en espermatòcits humans mitjançant immunocitofluorescència i stM-FISH

Abstract

Durant la profase I meiòtica els cromosomes homòlegs s'uneixen mitjançant sinapsi formant els bivalents i intercanvien material genètic per recombinació homòloga. Al llarg de l'eix de sinapsi s'estructura el complex sinaptinemal (CS). Anomalies de la sinapsi i de la recombinació meiòtica s'han considerat com dos possibles causes de bloqueig total o parcial de la meiosi. L'objectiu general d'aquet treball és estudiar la incidència d'anomalies sinàptiques i de recombinació en individus controls i infèrtils per a caracteritzar diferents graus d'anomalies en aquests processos en la infertilitat idiopàtica.<br/>S'han processat biòpsies testiculars de set individus control i de tretze infèrtils. La detecció immunofluorescent de proteïnes de CS (SCP1 i SCP3) i de llocs de recombinació (MLH1) s'ha utilitzat por primera vegada en combinació amb un mètode de hibridació in situ fluorescent amb múltiples sondes subtelomèriques específiques (stM-FISH), que permet la identificació de tots els SCs d'una cèl·lula a paquitè.<br/>Les regions d'heterocromatina no centromèrica, 9qh, 1qh, 16qh i braços curts dels cromosomes acrocèntrics, han presentat una major incidència d'anomalies sinàptiques, indicant que són les últimes regions del genoma en fer sinapsi. La incidència d'anomalies sinàptiques en aquestes zones varia entre individus, fet explicable per polimorfismes d'aquestes regions en la població general. Anomalies sinàptiques en altres zones, aquelles que afecten a varis CSs en un mateix nucli o aquelles presents en estadi de paquitè tardà podrien indicar una afectació severa de la sinapsis. Els CSs dels cromosomes 15 i 21 s'associen més freqüentment al parell de cromosomes sexuals possiblement degut a l'homologia existent entre les regions heterocromàtiques d'aquests cromosomes i la del cromosoma Y.<br/>L'anàlisi de la recombinació meiòtica ha mostrat que la recombinació homòloga en el parell XY pot ser un indicador de la freqüència general de recombinació i de la progressió de la meiosi. Els resultats confirmen que una menor freqüència de recombinació pot augmentar el risc d'univalents a metafase I i que les diferències entre individus en aquesta freqüència podrien explicar la variabilitat en la freqüència d'aneuploïdies en espermatozoides humans. Els resultats de distribució de punts de MLH1 en cada CS i de les distancies entre aquests punts ens ha permès proposar un model de com es distribueixen aquests punts al llarg del CS.<br/>L'anàlisi de la longitud del CS ha mostrat que cada un dels braços del CS, de manera independent a l'altre, pot variar la seva longitud relativa en comparació a la longitud relativa dels cromosomes mitòtics. En el treball s'evidencia que aquesta variació de la longitud relativa pot reflectir la quantitat de fibres compactes i no compactes de cromatina presents a la zona.<br/>Finalment, la observació d'una cèl·lula tetraploide en estadi de paquitè, possiblement originada per endoreduplicació, demostra que la sinapsi i la recombinació meiòtica poden tenir lloc en aquestes cèl·lules en humans. A més a més, permet suposar que aquestes cèl·lules són un altre possible origen de espermatozoides diploides.<br/>Durant el transcurs d'aquest estudi s'ha caracteritzat citogenèticament un isocromosoma dicèntric Yq(p11.32) en mosaic en un individuo azoospermic, mitjançant FISH amb sondes específiques pel cromosoma Y.

During meiotic prophase I, homologous chromosomes are joined forming bivalents and they exchange genetic material by the processes of synapsis and crossing over. The synaptonemal complex (SC) appears along the synapsis axis. Synapsis and crossover anomalies have been considered as two possible causes of partial or total meiotic arrest. The general aim of this study is to analyse the incidence of synaptic and crossover anomalies in controls and infertile men in order to characterise different degrees of anomaly in these processes in idiopathic infertility.<br/>Testicular biopsies from seven controls and thirteen infertile men have been processed. Immunolabelling of SC proteins (SCP1and SCP3) and of DNA mismatch repair proteins present in crossover foci (MLH1) has been applied, for the first time, in combination with the seven-fluorochrome subtelomere-specific multiplex FISH assay (stM-FISH) in order to analyse synapsis and crossovers individually in each SC of a nucleus at pachytene.<br/>SCs regions with non-centromeric heterochromatin, 9qh, 1qh, 16qh and short arms of acrocentric chromosomes, have presented the highest incidence of gaps and splits, indicating that these are the last regions in the genome to synapse. Interindividual variability in the incidence of synaptic anomalies in these regions may be explained by polymorphisms of these regions in the general population. Synaptic anomalies in other SC regions, those affecting several SCs or present in late pachytene nuclei may indicate nuclei with a severely affected synapsis. Autosomal SC15 and SC21 associate with the XY pair more frequently than other SCs, possibly due to the homology between non-centromeric heterochromatins in the short arm of chromosomes 15 and 21 and in the q arm of chromosome Y.<br/>The analysis of crossovers shows that the amount of XY pairs with a crossover could be an indicator for general crossover frequency and for a successful meiotic process. Results confirm that reduction in the crossover frequency may increase the risk of achiasmatic small bivalents, and that interindividual differences in crossover frequency could explain the variability in the frequencies of aneuploidy in human sperm. How MLH1 foci are positioned within the SC is discussed based on detailed MLH1 foci distributions and interfoci distances.<br/>SC length analysis has shown that SC arms can be longer or shorter than the corresponding mitotic ones. Moreover, for a given SC, the variation in length found in one arm was independent of the variation observed in the other one. Evidence that the variation of the SC arm length may reflect the abundance of open and of compact chromatin fibres in the arm is shown.<br/>The finding of a tetraploid pachytene, possibly originated by endoreduplication, demonstrates that synapsis and crossover events can occur in these cells in humans. Moreover, it indicates that diploid sperm may also originate from tetraploid meiotic cells.<br/>During this study, a dicentric Yq(p11.32) isochromosome has been cytogenetically characterised in an azoospermic male by FISH using specific probes for chromosome Y.