Immunological studies on Swine Influenza Virus in pigs: from gene to epitopes

Abstract

El virus de la gripe porcina (VGP) es un patógeno importante en el sector veterinario con un gran potencial zoonótico, y por lo tanto se considera también una amenaza potencial para la salud pública. La vigilancia y el control de este patógeno en cerdos es por lo tanto crucial. Los métodos actuales de control se basan en la profilaxis, en particular, en vacunas que suscitan una respuesta de tipo humoral. La capacidad de escape y la alta variabilidad de VGP hacen que la eficacia de estas vacunas pueda verse comprometida; por tanto, deben ser actualizadas periódicamente. El mismo problema se plantea en la salud humana donde se están desarrollando vacunas diseñadas racionalmente con tal de solventarlo. Estas vacunas están siendo diseñadas para potenciar la respuesta de células T contra el virus de la gripe A (VGA). La respuesta de células T esta relacionada con la protección contra la infección por el VGA, centrándose en las proteínas internas y altamente conservadas del virus. Esto permitiría resolver los problemas anteriormente citados. Los epítopos de células T de VGP conocidos en cerdos son sólo unos pocos y están relacionados con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad porcino de clase I (CMHpo-I). La vacunología inversa se utiliza en sanidad humana para identificar los epítopos de células T; sin embargo, en cerdos este concepto se ha sido introducido recientemente y por lo tanto se dispone de pocas herramientas. El objetivo principal de este trabajo era identificar epítopos de células T para diseñar racionalmente vacunas contra VGP. Para este propósito, se abordaron las siguientes estrategias. La vigilancia de VGP es fundamental para un control adecuado. La situación epidemiológica de VGP en España debía ser actualizada y se necesitaban más datos genéticos para permitir el uso de la vacunología inversa. El estudio realizado mostró que la situación epidemiológica de España era similar a la de otros países europeos; las cepas circulantes estaban estrechamente relacionadas y evolucionaron de la misma manera. Sin embargo, también se encontraron exepciones; una cepa evolucionó de forma divergente en España. Se sugiere que el cambio genético pueda ser un evento reciente en la evolución de esas cepas. Los ensayos in vitro para determinar la afinidad de unión de epítopos a CMHpo-I disponibles actualmente son pocos y están basados en moléculas recombinantes. Por lo tanto, en primera instancia se intentó generar una herramienta in vitro basada en la forma nativa del CMHpo-I. Para ello se diseñó y desarrolló casi por completo un ensayo de reconstitución de MHC aplicado a CMHpo-I, para el cual se generaron células C1R que expresaran el alelo SLA-1*es11 de los cerdos singénicos Babraham. Por último se puso a punto el ensayo de desnaturalización. A continuación, se aplicó la vacunología inversa para identificar epítopos de células T. Se predijeron epítopos del VGP in silico mediante NetMHCpan para los alelos CMHpo-I de los cerdos singénicos Babraham (SLA-1*es11 y SLA-2*es22); estos epítopos se probaron mediante ensayos funcionales ex vivo (IFNγ y respuesta de proliferación) usando células de cerdos Babraham inmunizados. Desafortunadamente, este enfoque no dio ningun epítopo positivo. Los epitopos de células T fueron también identificados empíricamente. Las proteínas M1 y NP de un VGA humano fueron seleccionadas como diana, se estudiaron mediante el uso de péptidos solapantes y métodos funcionales (IFNγ y respuestas de proliferación) hasta encontrar epítopos de células T. Los epítopos fueron analizados con células procedentes de cerdos Babraham inmunizados con VGA. Se encontraron dos epítopos CMHpo de clase II solapados, NP405-416 y NP407-420. En otro intento, se utilizó una estrategia más compleja de vacunología inversa. Esta había sido utilizada anteriormente por otros autores y comprende una combinación de métodos: predicción de epitopos in silico mediante NetMHCpan y validación de los resultados utilizando las preferencias de unión del alelo CMHpo determinadas in vitro, analisis in vitro mediante un ensayo de unión y analisis in vivo mediante tetrámeros. Los péptidos fueron identificados en animales infectados y expuestos a dos VGP heterólogos. Esta estrategia demostró ser muy precisa y así se identificó un epítopo inmunodominante (NA171-180). En general, estos datos allanan el camino para el diseño racional de una vacuna contra la SwIV a parte de proporcionar una nueva visión de la respuesta de los cerdos a la infección o inmunización con VGA.

Swine Influenza Virus (SwIV) is an important pathogen in veterinary field with a great zoonotic potential and thus it is considered also a potential threat for public health. Surveillance and control of this pathogen in pigs is therefore crucial. Current methods of control are based on prophylaxis; in particular they are based on vaccines eliciting humoral response. Escaping capacity and high variability of SwIV make that the efficacy of those can be compromised; thus vaccines need to be periodically updated. This problem is shared in human health and thus rationally designed vaccines are being developed. Those are being designed to enhance T cell response against Influenza A Virus (IAV). T cell responses showed to be related with protection against IAV infection, targeting the highly conserved internal protein of the virus. This would solve the problems above cited. T cell epitopes of SwIV in pigs are just few and related to class I Swine Leucocytes Antigens (SLA). Reverse vaccinology is used in human health to identify T cells epitope; however, in pigs this has just recently been introduced and thus just few tools were available. The main aim of this work was to identify T cells epitopes in SwIV to be used in rationally designed vaccines. For this purpose, the following studies were performed. Surveillance of SwIV is fundamental to design a proper control. The epidemiological situation of SwIV in Spain needed to be updated and more genetic data were required to allow the use of reverse vaccinology. The study showed that the epidemiological situation of Spain was similar to other European countries in which circulating strains were closed related and evolving in the same way. However, some exceptions were found; one strain evolved divergently in Spain. Genetic shift has been suggested as a recent event in the evolution of those strains. In vitro assays to determinate binding affinities of epitopes to class I SLA (SLA-I) available were few and based on recombinant molecules. Therefore, in a first instance an in vitro tool based on native forms of SLA-I was attempted. MHC reconstitution assay for SLA-I was designed and almost entirely developed. C1R cells expressing the Babraham pigs allele SLA-1*es11 were generated. Finally, the denaturalization step of the assay was set-up. Reverse vaccinology was then applied to identify T cells epitopes. Epitopes of the virus selected as target were predicted in silico by NetMHCpan on Babraham SLA-I alleles (SLA-1*es11 and SLA-2*es22) and tested by ex vivo functional assays (IFNγ and proliferation responses) using cells from immunised Babraham inbred pigs. Unfortunately, this approach did not give any positive epitope. Additionally, T cells epitopes were empirically identified. Proteins M1 and NP of a human IAV were selected as target and thus dissected by using overlapping peptides and functional methods (IFNγ and proliferation responses) until finding T cells epitopes. The tests were performed using cells from IAV immunised Babraham inbred pigs. Two overlapping SLA-II epitope were found, NP405-416 and NP407-420. In another attempt, a more complex strategy of reverse vaccinology was used. This was previously used by other authors and it is based on a combination of methods: in silico prediction of epitopes by NetMHCpan and validation of results by using in vitro binding preferences of the selected SLA-I allele , an in vitro test binding assay and in vivo test by tetramers. Peptides were identified in animals infected and challenged with two heterologous SwIV. This strategy showed to be highly accurate and thus one immunodominant epitope (NA171-180) was identified. Overall, these data pave the way for rational design of vaccine against SwIV as well as providing new insight into pig responses to infection or immunization with IAV.