Estrès i resposta immuno-endocrina en peixos. Caracterització del receptor glucocorticoide en l'orada (Sparus aurata) i el seu paper en la resposta inflamatòria

Abstract

El cortisol és el principal glucocorticoide en peixos teleostis, assumint també funcions com a mineralocorticoide. És el principal indicador de la resposta a l'estrès, però també participa en diverses vies metabòliques, és immunosupresor amb funcions antiinflamatòries i és la principal hormona osmorreguladora en peixos. Al fetge, els glucocorticoides augmenten la transcripció de gens implicats en la gluconeogènesi, en el catabolisme dels aminoàcids i en la resposta de fase aguda. La secreció de cortisol en peixos està regulada per l'eix hipotalàmico-pituitàrio-interrenal (HPI), equivalent a l'eix hipotalàmico-pituitàrio-adrenal (HPA) en mamífers. <br/>Les hormones corticosteroidees, en mamífers, actuen a través de receptors intracel·lulars específics: el receptor mineralocorticoide (MR) i el receptor glucocorticoide (GR). Ambdós actuen com a factors de transcripció depenents del lligand. Darrerament s'ha demostrat que algunes espècies de peixos expressen un MR i/o més d'un GR. En aquest treball hem clonat, per primera vegada, el GR de l'orada (Sparus aurata). La regió codificant es tradueix en una proteïna putativa de 784 aa i mostra elevada homologia amb els principals dominis funcionals, domini d'unió a DNA i domini d'unió a l'hormona, d'altres GR, inclosos els de mamífers. L'expressió del GR de l'orada és ubiqua en els teixits i s'ha detectat a tots els teixits estudiats: cor, fetge, melsa, ronyó anterior i posterior, intestí, gònada, teixit adipós, brànquia, cervell i múscul.<br/>La resposta global a l'estrès requereix la interacció neuro-immuno-endocrina mitjançant comunicacions paracrines bidireccionals. Aquesta comunicació és important per a mantenir la homeostasi en diferents condicions estressants, inclosa l'endotoxèmia. L'endotoxina dels bacteris gramnegatius o LPS, en els vertebrats, desencadena una reacció immunitària complexa que implica la producció de citoquines proinflamatòries per part dels macròfags, principalment el TNF? (factor de necrosi tumoral ?) i la IL-1? (interleuquina 1 beta). Les citoquines produïdes en resposta al LPS estan implicades també en l'activació de l'eix HPA i activen, per tant, l'alliberació de cortisol. <br/>Els nostres resultats mostren que l'administració in vivo de LPS estimula l'eix HPI en l'orada desencadenant l'alliberació de cortisol, seguint un patró de resposta aguda. Aquesta hormona modula la resposta inflamatòria inhibint la producció de citoquines induïdes per LPS. El nostre estudi mostra que aquesta regulació es podria donar a través del GR perquè interfereix amb els factors de transcripció encarregats d'induir la transcripció de gens implicats en la resposta inflamatòria. L'expressió del GR en l'orada després d'una injecció de LPS ve regulada de manera específica segons el temps i el teixit. En general, veiem que existeix una correlació inversa entre els nivells de cortisol plasmàtic i els nivells d'expressió del GR en els teixits. La injecció intraperitoneal de LPS també augmenta l'expressió d'altres gens immunes (TNF?, IL1?, proteïna Mx, catepsina D, receptor activat proliferador de peroxisoma gamma (PPAR?)) en els principals teixits immunològics de l'orada, concretament a ronyó anterior, melsa, intestí anterior i brànquies. Els canvis en l'expressió d'aquests gens són diferents en funció del teixit i el temps.<br/>En el cultiu primari d'hepatòcits d'orada, dosis baixes d'un estímul immune (rTNF?) o endocrí (cortisol) alteren l'expressió de gens immunes (TNF?, IL1? i PPAR?) i endocrins (GR, catD), respectivament. Aplicant dosis més elevades es disminueix l'expressió de TNF? i GR, 12 hores després del tractament endocrí però no es detecten canvis amb el tractament immune. Els canvis en l'expressió d'aquests dos gens, després del tractament endocrí amb dosis altes, segueix una seqüència temporal, ja que 3 hores després augmenta l'expressió del GR i disminueix l'expressió del TNF?. Aquesta resposta demostra que, en peixos, la resposta inflamatòria pot estar regulada per les interaccions entre el cortisol i el seu receptor (GR).<br/>Finalment, la perca europea (Perca fluviatilis) sotmesa a factors estressants típics de les pràctiques aqüícoles (transport i manipulació) mostra la resposta fisiològica primària d'alliberació de cortisol però baix nivell d'activitat en les respostes secundàries, com la glucosa i el lactat.

Cortisol is the main glucocorticoid in teleosts, playing a rule also as mineralocorticoid. It is the main stress response indicator, but also participates in different metabolic pathways, as an immune-supressor with antiinflamatory actions and is the main osmorregulatory hormone in fishes. In the liver, glucocorticoids increase the gene transcription involved in gluconeogenesis, in the catabolism of amino acids and in the acute phase response. Cortisol secretion in fishes is regulated by the hypothalamic-pituitary-interrenal axis (HPI), equivalent to the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) in mammals. <br/>In mammals, corticosteroids hormones act by specific intracellular receptors: mineralocorticoid receptor (MR) and glucocorticoid receptor (GR) that act as ligand-dependant transcription factors. Recently, it has been demonstrated that some fish species can express one MR and/or more than one GR. In this work we have cloned, for the first time, GR of gilthead sea bream (Sparus aurata). The coding region translate to a putative protein of 784 aa and shows high homology with other species, including mammals, within the most important functional domains; DNA binding domain and hormone binding domain. Sea bream GR expression is ubiquitous in tissues and has been detected in all tissues studied: heart, liver, spleen, anterior and posterior kidney, intestine, gonads, adipose tissue, gill, brain and muscle.<br/>General response to stress, demands neuro-immune-endocrine interaction through bidireccional paracrine communication. This communication is important to maintain homeostasis under different stress conditions, including endotoxin stress. Gram-negative bacterial endotoxin or LPS, in vertebrates, induces a complex immune reaction that involves pro-inflammatory cytokine production by macrophages, mainly TNF? (tumor necrosis factor ?) and IL-1? (interleukin 1 beta). LPS-induced cytokines are involved in HPA activation and therefore activate cortisol release. <br/>Our results show that LPS in vivo administration stimulates the HPI axis in sea bream resulting in cortisol release, in an acute fashion. This hormone modulates the inflammatory response by inhibiting LPS-produced cytokines. Our study show that this regulation could be produced by GR as it is interfering with transcription factors involved in inducing inflammatory gene transcription. Sea bream GR expression after an LPS injection is specifically regulated in both time and tissue context. In general, we have observed that there is a reverse correlation between plasma cortisol levels and tissue GR expression levels. LPS intraperitoneal injection also increases immune gene expression (TNF?, IL1?, Mx protein, cathepsin D, peroxisome proliferator activated gamma (PPAR?)) in immunological tissues in sea bream, specifically head kidney, spleen, anterior intestine and gills. Changes in gene expression is both time and tissue dependant.<br/>In primary cultured hepatocytes of sea bream, low doses of an immune stimulation (rTNF?) or endocrine stimulation (cortisol) modifies expression of immune gene (TNF? IL1? i PPAR?) and endocrine genes (GR, catD), respectively. The highest doses applied decrease TNF? and GR expression 12 hours after endocrine treatment but there are no changes after immune treatment. Observed changes in gene expression follow a temporal response; 3 hours after a high dose of cortisol, GR expression increases and TNF? expression decreases. This response shows that, in fishes, inflammatory responses may be mediated by GR-cortisol interaction.<br/>Finally, European perch (Perca fluviatilis) subjected to typical stressor factors in aquaculture (transport and handling) have shown primary physiological response of cortisol release but a slow level in secondary responses such as glucose and lactate.