Coordinación de las actividades ATPasa y SUMO-ligasa en el complejo Smc5/6: implicaciones en reparación de cromosomas

Abstract

Uno de los aspectos más sorprendentes del proceso de división celular es la capacidad de duplicar y transmitir los cromosomas a las células hijas con enorme precisión. Las proteínas SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) forman una familia de ATPasas esenciales durante los procesos de replicación, reparación y segregación de los cromosomas. En las células eucariotas hay tres complejos proteicos de tipo SMC: cohesina, condensina y Smc5/6. Este último es necesario para que los cromosomas estén bien resueltos en el momento de su segregación y, a diferencia de los otros dos complejos SMC, tiene una subunidad con actividad SUMO-ligasa, conocida como Mms21 o Nse2. La presencia de una SUMO-ligasa en el complejo sugiere que éste pueda tener funciones de señalización además de estructurales. Mms21 se une a los dominios coiled-coil de la proteína Smc5 y sumoila varias subunidades del complejo además del mismo Smc5. Curiosamente, Mms21 también participa en la sumoilación de varias subunidades en los complejos cohesina y condensina. Aunque la función SUMO-ligasa de Mms21 no es esencial para la viabilidad celular, sí lo es para el mantenimiento de la integridad genómica. Es por ello que conocer su mecanismo de activación es de gran importancia. En este trabajo proponemos que la actividad ATPasa del complejo Smc5/6 está mecanísticamente acoplada a la activación de la SUMO-ligasa Mms21. Por un lado mostramos que la ligasa Mms21 necesita unirse al complejo Smc5/6 para acceder a sus dianas. A través del estudio de distintos mutantes ATPasa, mostramos que la activación de la SUMO-ligasa requiere como mínimo la unión a ATP e interacción entre los dominios ATPasa de Smc5 y Smc6, pero no la hidrólisis de ATP. A pesar de que los dominios SUMO-ligasa y ATPasa se encuentran en zonas distantes en la molécula, las dos actividades se comunican a través de los dominios coiled-coil de Smc5. Además, la activación de Mms21 requiere la presencia de disrupciones evolutivamente conservadas en los dominios coiled-coil. Proponemos que estas disrupciones funcionarían a modo de articulaciones que permitirían los cambios conformacionales necesarios para activar la ligasa Mms21. La coordinación de estas dos funciones en un mismo complejo proteico es extremadamente útil para la célula y la estabilidad de su genoma, ya que permite integrar un papel estructural en la cromatina, dependiente de la actividad ATPasa, con una función de señalización a través de SUMO, promoviendo así la correcta reparación y segregación de los cromosomas. Finalmente, en este estudio hemos diseccionado la región del coiled-coil donde recae la sumoilación de Smc5, con el fin de generar mutantes no sumoilables y analizar su función. Nuestros resultados indican que la sumoilación de Smc5 es prescindible para la reparación de daño en DNA durante la replicación del genoma; sin embargo, sí parece ser necesaria en condiciones de acumulación de intermediarios de recombinación, lo cual sugiere la participación de la sumoilación de Smc5 en el metabolismo de este tipo de estructuras.

Un dels aspectes més sorprenents del procés de divisió cel·lular és la capacitat de duplicar i transmetre els cromosomes a les cèl·lules filles amb una precisió enorme. Les proteïnes SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) formen una família d’ATPases essencials durant els processos de replicació, reparació i segregació dels cromosomes. En les cèl·lules eucariotes hi ha tres complexos proteics de tipus SMC: cohesina, condensina i Smc5/6. Aquest últim és necessari per a què els cromosomes estiguin ben resolts en el moment de la seva segregació i, a diferència dels altres dos complexos SMC té una subunitat amb activitat sumo-lligasa, coneguda com Mms21 o Nse2. La presència d'una sumo-lligasa en el complex suggereix que aquest pugui tenir funcions de senyalització a més d'estructurals. Mms21 s'uneix als dominis coiled-coil de la proteïna Smc5 i sumoila diverses subunitats del complex a més del mateix Smc5. Curiosament, Mms21 també participa en la sumoilació de diverses subunitats en els complexos cohesina i condensina. Tot i que la funció sumo-lligasa de Mms21 no és essencial per a la viabilitat cel·lular, sí que ho és per al manteniment de la integritat genòmica. És per això que conèixer el seu mecanisme d'activació és de gran importància. En aquest treball proposem que l'activitat ATPasa del complex Smc5/6 està mecanísticament acoblat a l'activació de la sumo-lligasa Mms21. D'una banda mostrem que la lligasa Mms21 necessita unir-se al complex Smc5/6 per accedir a les seves dianes. A través de l'estudi de diferents mutants ATPasa, mostrem que l'activació de la sumo-lligasa requereix com a mínim la unió a ATP i interacció entre els dominis ATPasa de Smc5 i Smc6, però no la hidròlisi d'ATP. Tot i que els dominis sumo-lligasa i ATPasa es troben en zones distants en la molècula, les dues activitats es comuniquen a través dels dominis coiled-coil de Smc5. A més, l'activació de Mms21 requereix la presència de disrupcions evolutivament conservades en els dominis coiled-coil. Proposem que aquestes disrupcions funcionarien a mode d'articulacions que permetrien els canvis conformacionals necessaris per activar la lligasa Mms21. La coordinació d'aquestes dues funcions en un mateix complex proteic és extremadament útil per a la cèl·lula i l'estabilitat del seu genoma, ja que permet integrar un paper estructural en la cromatina, dependent de l'activitat ATPasa, amb una funció senyalitzadora a través de SUMO, promovent així la correcta reparació i segregació dels cromosomes. Finalment, en aquest estudi hem disseccionat la regió del coiled-coil on recau la sumoilació de Smc5, per tal de generar mutants no sumoilables i analitzar la seva funció. Els nostres resultats indiquen que la sumoilació de Smc5 no és essencial per a la reparació de dany a DNA durant la replicació del genoma; no obstant això, sí que sembla ser necessària en condicions d'acumulació d'intermediaris de recombinació, la qual cosa suggereix la participació de la sumoilació de Smc5 en el metabolisme d'aquest tipus d'estructures.

One of the most surprising aspects of cell division is the ability to duplicate and transmit chromosomes to daughter cells with great precision. SMC (Structural Maintenance of Chromosomes) proteins are a family of essential ATPases required for the replication, repair and segregation of chromosomes. In eukaryotic cells there are three different SMC complexes: cohesin, condensin and Smc5/6. The latter is necessary for proper resolution of chromosomes at the time of segregation, and unlike the other two SMC complexes, has a subunit with SUMO ligase activity, known as Mms21 or Nse2. The presence of a SUMO ligase in the complex suggests that it may have signaling roles besides its structural functions. Mms21 binds to the coiled-coil domain of the Smc5 protein and sumoylates Smc5 and other subunits in Smc5/6. Interestingly, Mms21 also participates in sumoylation of several subunits in the cohesin and condensin complexes. Although the SUMO ligase function in Mms21 is not essential for cell viability, it is required for the maintenance of genomic integrity. Therefore, understanding how the mechanisms that trigger its activation are of great importance. In this work we propose that the ATPase activity of the Smc5/6 complex is mechanistically coupled to the activation of the Mms21 SUMO ligase. On the one hand we show that the Mms21 ligase needs to bind to the Smc5/6 complex to access its targets. Through the study of various ATPase mutants, we further show that activation of the SUMO ligase requires ATP binding to Smc5 and engagement of Smc5 and Smc6 ATPase heads, but not ATP hydrolysis. Although the SUMO ligase and ATPase domains are located in different regions of the Smc5/6 molecule, the two activities are communicated through the coiled-coil domains of Smc5. Furthermore, activation of the SUMO ligase requires the presence of evolutionarily conserved disruptions in the coiled-coil domains. We propose that these disruptions operate as joints that allow the conformational changes necessary to activate the Mms21 ligase. The coordination of these two functions in the same protein complex is extremely useful for the genome stability as it allows integrating a structural role on chromatin, dependent on the ATPase activity, with a signaling function through SUMO, thus enhancing the correct disjunction and segregation of chromosome. Finally, in this study we have dissected the coiled-coil region in the Smc5 molecule that is targeted by SUMO, and we have generated unsumoylatable mutants to study the role of Smc5 sumoylation. Our results indicate that sumoylation of Smc5 is not required for the repair of damage during DNA replication; however, Smc5 sumoylation becomes critical under conditions that trigger accumulation of unresolved recombination intermediates, suggesting the participation of Smc5 modification in the metabolism of these type of structures.