Caracterització del degradoma d'ADAM17: Paper de l'endocitosi en el control de l'activitat de proTGF-(alfa) i identificació de nous substrats de la metal·loproteasa

Abstract

Un dels mecanismes implicats en la regulació de l'activitat de les proteïnes de la superfície cel·lular s'anomena shedding i consisteix en un tall proteolític que dóna lloc a l'alliberament de la regió extracel·lular d'aquestes. Aquest mecanisme està molt especialitzat i és bàsicament responsabilitat de la superfamília de metal·loproteases dependents de zinc anomenada metzincina, la qual inclou les metal·loproteases de matriu extracel·lular (MMPs) i les ADAM (A Disintigrin And Metalloprotease domain). Aquestes últimes, les proteases de la família ADAM, s'han relacionat amb tumorogènesi ja que alguns dels seus membres se sobreexpressen en tumors procedents d'una gran varietat de teixits. Tenint en compte aquesta dada diversos grups de recerca han iniciat assajos clínics amb inhibidors d'aquestes proteases que inesperadament han fracassat. L'explicació a aquest resultats la trobem, probablement, a la complexitat funcional de les ADAM deguda a la diversitat de molècules que formen el seu degradoma i, també, al desconeixement de part dels components d'aquest conjunt. Un dels membres més importants de la família ADAM, degut a la seva sobreexpressió en determinats tumors, i més ben estudiada en el laboratori és ADAM17. Aquesta proteasa té com a substrat a un factor de creixement que juga un paper important en la tumorogènesi anomenat proTGF-?. El shedding d'aquest factor de creixement és crític ja que només així s'obté la seva forma soluble activa. Donats aquests antecedents i amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement del paper d'ADAM17 en la tumorogènesi ens varem plantejar, per una banda, estudiar el paper de l'endocitosi en la regulació de la disponibilitat de proTGF-? per part d'ADAM17 a la superfície cel·lular i, per l'altra, la identificació de nous substrats d'ADAM17, mitjançant la tècnica proteòmica del DIGE (Differential Gel Electrophoresis). Els resultats del primer punt ens varen permetre concloure que proTGF-? és un factor de creixement que regula els seus nivells a la superfície cel·lular mitjançant la seva endocitosi i posterior reciclatge. A més a més, també varem poder observar que el domini citoplasmàtic de proTGF-? és important en el control de l'endocitosi ja que la seva absència clarament bloquejava aquest procés donant lloc a un increment del factor de creixement a la superfície cel·lular. Per altra banda, l'absència del domini citoplasmàtic no interfereix en la capacitat d'ADAM17 per tallar proteolíticament proTGF-? però si que incrementa la capacitat del factor de creixement per activar el seu receptor. Tot això indica que el domini citoplasmàtic del factor de creixement controla la disponibilitat de proTGF-? a la superfície cel·lular i, per tant, la capacitat de produir la seva forma activa.<br/>Respecte al segon objectiu, els resultats obtinguts varen permetre identificar tres substrats de shedding: El receptor de transferrina (TfnR) i les molècules d'adhesió desmogleina 2 (Dsg-2) i ALCAM els quals es varen confirmar com a substrats mitjançant western-blot. En el cas de la Dsg-2 varem determinar que és substrat d'ADAM17 només en condicions de sobreexpressió de la metal·loproteasa mentre que ADAM10 és la principal responsable del seu shedding. Respecte a la regulació del shedding de Dsg-2 hem demostrat que l'EGF augmenta el seu processament proteolític. Cal dir també que hem caracteritzat una nova forma de Dsg-2 que no té el domini citoplasmàtic. Molt probablement la seva formació es degui a l'activitat d'una proteasa desconeguda que no hem aconseguit caracteritzar. <br/>En el cas d'ALCAM és ADAM17 la principal responsable del seu shedding. L'estudi de la regulació del seu tall proteolític ens ha permès determinar que en condicions d'elevada confluència cel·lular augmenta el shedding d'aquesta molècula d'adhesió.

Protein ectodomain shedding is a mechanism involved in the regulation of the activity of a variety of cell surface molecules consisting in a specialized type of limited proteolysis that releases the extracellular domain of these proteins. The shedding events are basically responsibility of zinc-dependent metalloproteases of the metzincin superfamily, which includes the ADAM (A Disintigrin And Metalloprotease domain) and the matrix metalloproteases (MMPs) families. The ADAM familiy of metalloproteases have been involved in tumorigenesis since most of them are overexpressed in a wide variety of tumors. Therefore, different inhibitors of metalloproteases have been used in clinical assays which were terminated prematurely because of patients showed no survival benefits. These results were probably due either to the functional complexity of the substrates or perhaps to the ignorance of the degradome of ADAMs. On the other hand, ADAM17, probably the best known member of the ADAMs family, is the responsible for the shedding of the growth factor proTGF-? which has been also involved in tumorigenesis. It is important to know that the shedding of proTGF-?, which happens in the cell surface, is extremely important since the growth factor is active only when shed. Thus, taken all together, the aims of this work were, first, to analyze how the endocytosis regulates the availability of proTGF-? in the cell surface and, secondly, to identify new substrates of ADAM17 by DIGE (Differential Gel Electrophoresis).<br/>The results of the first aim allowed us to conclude that both endocytosis and recycling of endocytic vesicles to the cell surface regulate the availability of proTGF-? in the plasma membrane. Moreover, the cytoplasmic domain of proTGF-? regulates the endocytosis of the growth factor since its absence completely blocks its internalization. Finally, the accumulation of proTGF-? as a consequence of the inhibition of the endocytosis leads to an overactivation of its receptor.<br/>The results of the second aim allowed us to identify new substrates of shedding: The transferrin receptor (TfnR) and two adhesion molecules so-called ALCAM and Desmoglein 2 (Dsg-2). All of them were confirmed by western-blot. The main metalloprotease responsible for the shedding of Dsg-2 is ADAM10 while ADAM17 sheds it only when overexpressed. Concerning to the regulation of the shedding of Dsg-2 is important to note that EGF can activate it. Moreover, we characterized a new form of Dsg-2, which lacks of the intracellular domain, whose formation is due most likely to the activity of an unknown intracellular protease.<br/>In the other hand, the main metalloprotease responsible for the shedding of ALCAM is ADAM17. Furthermore, the analysis of the mechanisms involved in the regulation of the shedding allowed us to conclude that it increases concomitantly to the increase of cell density.