Implicación de las citoquinas TNF-α E IL-6 y de las metalotioneínas en la neuroinflamación desencadenada por lesión cerebral

Abstract

La respuesta frente a lesiones traumáticas está orquestada por las citoquinas, grupo heterogéneo de proteínas de bajo peso molecular implicadas en la señalización intercelular, tales como la interleuquina-6 (IL-6) o el factor de necrosis tumoral alfa (TNF)-&#945;. Pese a que estos dos factores fueron originalmente descritos como inductores y mediadores de la vertiente pro-apoptótica de la respuesta inflamatoria también se han observado implicaciones beneficiosas de estas citoquinas en la recuperación y supervivencia del parénquima nervioso frente a agresiones de diversa naturaleza. Entre los factores neuroprotectores inducidos por la IL-6 en respuesta a lesión se encuentran las metalotioneínas (MTs), proteínas de bajo peso molecular y ricas en cisteínas con un claro papel antioxidante, antiapoptótico y neurotrófico, pudiendo mediar en parte las acciones beneficiosas de esta citoquina, sugiriéndose por tanto un potencial uso terapéutico de estas proteínas.<br/>Mediante el uso de animales modificados genéticamente hemos aportado resultados sobre el papel que tanto la IL-6, como el TNF-&#945; o las metalotioneínas pueden tener en procesos patológicos y/o daño en el sistema nervioso central, habiéndose usado ratones que sobreexpresan IL-6 específicamente a cerebro (ratones GFAP-IL6), ratones con una deleción en el gen de la IL-6 (ratones IL6KO) , ratones con deleciones bien del receptor 1 o del receptor 2 del TNF-&#945; (ratones TNFR1KO y TNFR2KO respectivamente) y ratones con deleción en los genes de la metalotioneína 1 y 2 (MTKO) con o sin tratamiento exógeno de MTs nativas y recombinantes. Estos ratones han sido sometidos a un proceso lesivo como la criolesión, consistente en la aplicación de un pellet de nieve carbónica durante 30 segundos en el cráneo del animal.<br/>Se ha analizado neurohistológicamente los diferentes animales mediante técnicas immunohistoquímicas así como la expresión génica de diferentes marcadores de apoptosis, supervivencia y de reposta inflamatòria mediante técnicas de biología molecular tales como la hibridación in situ, microarrays y Ribonuclease Protection Assay (RPA). También hemos evaluado el estado funcional de los animales mediante técnicas conductuales como el elevated plus maze (EPM), el holeboard (HB) o el horizontal ladder beam (HLB). <br/>Los resultados obtenidos permiten concluir que si bien la sobreexpresión de IL-6 de manera crónica es perjudicial, estos animales presentan una reducida muerte celular y menor estrés oxidativo, sugiriendo la participación de esta citoquina en procesos de supervivencia, seguramente mediante la inducción de la síntesis de factores antioxidantes y antiapoptóticos. Los animales IL6KO presentan una reducida respuesta inflamatoria pero un incremento en los niveles de marcadores de estrés oxidativo y, probablemente por este motivo, un incremento en la muerto celular apoptótica tras la criolesión. En este sentido, los animales MTKO presentan un fenotipo muy similar tras lesión, mientras que la administración exógena de MTs revierte estos efectos, independientemente de la homologia con la especie de la cual se ha obtenido la MT, sugiriendo una acción independiente de receptor y abriendo posibles usos terapéuticos de las MTs.<br/>La deficiencia en la señalización del TNF-&#945;, ya sea por el receptor 1 o 2 comporta una disminución del daño a nivel molecular, observándose una disminución tanto de genes implicados en la respuesta celular a lesiones, como de marcadores pro-inflamatorios y una menor activación de vías apoptóticas. Este menor daño se correlaciona con un menor daño a nivel funcional. A nivel conductual tanto los animales TNFR1KO como los TNFR2KO presentan una mayor actividad exploratoria respecto sus controles.<br/>Estos resultados aportan nuevas pruebas de la importancia del TNF-&#945; y la IL-6 en procesos inflamatorios, y su papel dual, siendo mediadores tanto de procesos pro-apoptóticos como de supervivencia (mediados, en parte, por las MTs) dependiendo del nivel de expresión y, muy probablemente, de la célula en la cual está actuando.

Inflammatory response alter traumatic brain injury is orchestrated by cytokines, a complex group of proteins implicated in intercellular signalling, such as interleukin (IL)-6 or tumoral necrosis factor (TNF)-&#945;. Although these two factors were originally described to mediate the pro-apoptotic responses of inflammation, they have recently been described to exert beneficial actions in both the cell survival and tissue recovery after injury. Among the factors induced by IL-6 one can find metallothioneins (MTs), low-weight, cysteine-rich proteins with antioxidant, antiapoptotic and neuroprotective actions; which could mediate, at least in part, the beneficial actions of IL-6.<br/>The use of genetically modified mice has allowed us to gain insight in the role of IL-6, TNF-&#945; and MTs in the pathophysiology of the central nervous system. We have used animals lacking the IL-6 gene (IL6KO), mice overexpressing IL-6 in the brain (GFAP-IL6 mice), mice lacking either TNF-&#945; receptor 1 or receptor 2 (TNFR1KO and TNFR2KO) and animals lacking MT-I and MT-II (MTKO mice) treated with saline solution or with exogenous MTs. All of these mice were subjected to a focal freeze injury such as cryolesion, placing a dry ice pellet for 30 seconds on the parietal bone.<br/>The neurohistological status of these animals was assessed by means of immunohistochemistry. Gene expression of several apoptotis, survival and inflammatory response markers was assessed by in situ hybridization, microarray and ribonuclease protection assay (RPA). The functional status of these mice was also assessed by behavioural tests, namely elevated plus maze (EPM), hole board (HB) and horizontal ladder beam (HLB).<br/>Our present results show that although chronic IL-6 expression is detrimental, GFAP-IL6 mice show reduced cell death and lower oxidative stress, suggesting a role for IL-6 in survival, which may be mediated by inducing antioxidant and antiapoptotic factors. IL6KO animals, on the other hand, show a decreased inflammatory response but an increase in cell death after lesion. In this regard, MTKO mice present a similar phenotype after injury which can be reverted by exogenous MT administration, an effect which does not depend on the homology of the different MT isoforms and mice, suggesting a receptor-independent action, opening a possible therapeutic use for MTs.<br/>Deficiency in TNF-&#945; signalling, by lack of either receptor 1 or 2, involves a reduction in the tissue damage, with a reduction in genes involved in cellular response to lesion altogether with reduced pro-inflammatory markers and lower activation of pro-apoptotic pathways. This reduced damage correlates with a better functional response. Behaviourally, both TNFR1KO and TNFR2KO mice show an increased exploratory activity compared to the control mice.<br/>In conclusion, our results give new insights in the importance of TNF-&#945; and IL-6 in inflammatory processes, and their dual role, being mediators both of pro-apoptotic and survival responses, being the alter in part mediated by MTs. This dual response may depend on the level of expression and, very likely, on the cell where it is acting.