Análisis de la expresión de btk, lck, SAP, ICOS y células B de memoria en pacientes con Inmunodeficiencia Variable Común

Abstract

La Inmunodeficiencia Variable Común (IDVC) es la inmunodeficiencia primaria (IDP) sintomática más frecuente. Los pacientes con IDVC presentan un fenotipo clínico (infecciones recurrentes,etc) y un fenotipo inmunológico (hipogammaglobulinemia y respuesta nula de anticuerpos). El diagnóstico de IDVC se realiza por exclusión de otras causas de hipogammaglobulinemia. La existencia de casos atípicos, el solapamiento de fenotipos con otras IDPs y la ausencia de pruebas de laboratorio específicas de IDVC dificulta realizar un diagnóstico diferencial correcto. Recientemente, se han descrito algunos defectos monogénicos (ICOS, CD19, TACI y BAFFR) relacionados con IDVC (~10% pacientes IDVC). <br/>En el presente trabajo hemos estudiado: un método de cribaje (expresión de Btk, Lck y SAP), la asociación entre las células B de memoria y la gravedad/evolución clínica y el papel del ICOS como causa genética de la IDVC. El estudio de la expresión de Btk, lck y SAP se realizó mediante western blot (n=55 pacientes-IDVC,37 varones y 18 mujeres, media: 36,6a). El extracto de proteínas se obtuvo a partir de PBMC con NP-40 en condiciones reductoras, la electroforesis se realizó en geles de poliacrilamida de 4-12%, la transferencia en sistema semi-seco en membrana de nitrocelulosa, los anticuerpos primarios utilizados (anti-Btk: ac.mono. BD-Transduction laboratories, anti-lck: ac.mono. BD-Pharmingen, anti- SAP: ac. policlonal de conejo (K. Nichols) y la inmunodetección con un substrato Quimioluminiscente (SuperSignalR West Pico). Del total de los pacientes estudiados sólo en un paciente la expresión de la banda Btk fue negativa, confirmado por estudio de la Btk intracelular en monocitos por citometria de flujo y por análisis genético (P597L). La expresión de Lck y SAP fue normal en todos los pacientes.Se estudiaron las subpoblaciones de linfocitos B de memoria (CD19+CD27+) mediante citometria de flujo (FACSCalibur) en 41 pacientes adultos (21 varones y 20 mujeres, media: 37a) y se clasificaron en 3 grupos: 1) Grupo BM2 incluye pacientes con un número de LB de memoria con (CD19+CD27+IgD-) y sin cambio de isotipo (CD19+CD27+IgD+) dentro de los valores de referencia, n=7, 2) Grupo BM1 incluye pacientes con una reducción significativa de CD19+CD27+IgD- <6%, n=16 y 3) Grupo BM0 incluye pacientes que presentan una reducción significativa de los dos tipos de LB de memoria (CD19+CD27+ <13%), n=18. Se Observó una asociación entre los defectos de LB de memoria y la gravedad fenotípica clínica de los pacientes. En el grupo BM0, el 55% de pacientes con infecciones respiratorias recurrentes, desarrolló bronquiectasias con expectoración habitual, comparado con el 27% de los pacientes del grupo BM1 y el 0% del grupo BM2 (p<0.05). En el grupo BM0, el 50% de los pacientes con síntomas gastrointestinales, desarrolló el síndrome de malabsorción, comparado con el 19% del grupo BM1 y el 0% del BM2 (p<0.05). Los signos de linfoproliferación fueron más frecuentes en el grupo BM0 (50%) que en el grupo BM1 (16%) y BM2 (14%), (p<0.05).<br/>Se analizó la expresión de ICOS en la membrana de linfocitos T activados (48h con PMA+ionomicina, anti-ICOS-FITC C398.4A (J.Rojo), FACSCalibur) en pacientes IDVC con historia familiar de IDPs y/o enfermedades autoinmunes (4 familias, n=13). No encontramos ninguna alteración en la expresión de esta molécula en los pacientes estudiados.<br/>En conclusión, aunque el error diagnóstico encontrado en nuestro estudio es pequeño y la frecuencia del defecto ICOS es muy baja creemos que se debería incluir en el algoritmo de trabajo de soporte al diagnóstico un sistema de cribaje que incluya el estudio de proteínas asociadas a IDP con fenotipo de IDVC. La asociación entre la alteración inmunofenotípica B (BM0, BM1, BM2) y la gravedad fenotípica clínica justifica la inclusión de la determinación de los LB de memoria en el estudio inmunológico rutinario de los pacientes con IDVC.

Common Variable immunodeficiency (CVID) is a primary immunodeficiency (PID) with symptoms more frequently. The patients with CVID have a clinical phenotype (recurrent infections, etc.) and an immunologic phenotype (hypogammaglobulinemia and poor response an antibody's). The diagnosis of CVID is to make in order to rule out other causes of hypogammaglobulinemia. The existence of atypical cases, flapping of phenotypes with other PIDs and the absence of test specifics of CVID to hinder make a differential diagnosis correct. Recently, was described some monogenic defects (ICOS; CD19, TACI y BAFFR) related with CVID (~ 10% CVID patients).<br/>In this work, we are studied: a screening method (expression of btk, lck and SAP), the association between B cells memory and the severity/ clinical evolution and the role of ICOS how genetic cause of CVID. The study of expression of btk, lck, and SAP was making with western blot (n=55 patients-CVID, 37 man and 18 women, media: 36,6y). The extract of proteins was getting of PBMC with NP-40 in reduce conditions the electrophoresis was making in poliacrylamida gels of 4-12%, the transference in semi-dry system in nitrocellulose membrane, the primary antibody were (anti-btk: monoab. -Transduction laboratories, BD, anti-lck: monoab. Pharmingen, BD, anti-SAP: polyclonal ab of rabbit (K. Nichols) and the immunodetection with quimioluminiscente substrate (SuperSignal R West Pico). Of the total patients studied only one, the expression of the btk gang was negative, confirmed for studied of intracellular btk in monocytes for flow cytometry a genetic study (P597L). The expression of lck and SAP was normal in all the patients. <br/>The B cells subpopulations of memory (CD19+CD27+) was studied for flow cytometry (FACSCalibur) in 41 adults patients (21 man and 20 women, media 37y) and has been classified in 3 groups: 1) BM2 group include patients with number of memory B cells with (CD19+CD27+IgD-) and without isotype switched (CD19+CD27+IgD+) inside the reference levels, n=7, 2) BM1 group include patients with a significance reduction of CD19+CD27+IgD- <6%, n=16 y 3) BM0 group include patients with significance reduction of two types of memory BL (CD19+CD27+ <13%) n=18. We observed an association between defects of memory B cells and the severity clinical phenotype of the patients. In the group BM0, the 55% of patients with recurrent respiratory infections, development bronchiectasias with usual expectoration compared with the 27% of patients of the BM1 group and 0% of BM2 group (p<0.05). In the group BM0, the 50% of patients with symptoms gastrointestinal development the malabsortion syndrome, compared with the 19% of the group BM1 and the 0% of BM2 (p<0.05). The signs of lymphoproliferation were more frequent in the BM0 group (50%) than BM1 group (16%) and BM2 (14%), (p<0.05).<br/>Was analysed the expression of ICOS in the membrane of lymphocytes activated (48h with PMA+ionomicin), anti-ICOS-FITC C398.4A (J.Rojo), FACSCalibur in patients with CVID with familiar history of PIDs and/o autoimmune diseases (4 families, n=13). No find any alteration of the expression of this molecule in the patients studied.<br/>In conclusion, even though the error diagnosis fined in our studied is small and the frequency of the ICOS defect is low, we believe that should be include in the algorithm of work support al diagnosis, a system screening that include the protein studied associate a PID with phenotype of CVID. The association between the alteration immunophenotypic B (BM0, BM1, and BM2) and the severity clinical phenotype justify the inclusion of the determination of the memory B cell in the immunologic study routine of the patients with CVID.