Diagnóstico Molecular de Enfermedades de Base Genética que afectan al Sistema Inmune

Abstract

Las inmunodeficiencias primarias constituyen un grupo de enfermedades de etiología diversa que tienen en común un defecto cualitativo o cuantitativo del sistema inmunitario a consecuencia del cual se alteran sus funciones, comprometiendo la defensa contra las agresiones externas. En el presente trabajo se describen las características clínicas e inmunológicas de pacientes con sospecha de inmunodeficiencia primaria o síndromes linfoproliferativos en los que se llevó a cabo el diagnóstico molecular. <br/>Se evaluó la capacidad oxidativa de granulocitos en una paciente que había sufrido infecciones de repetición por bacterias catalasa positiva, observándose la falta de producción de superóxido. El estudio genético de la subunidad p47-phox de la NADPH-oxidasa mostró una deleción del dinucleótido GT al inicio del exón 2 del gen NCF1, siendo diagnosticada de Enfermedad Granulomatosa Crónica. <br/>Se estudió el caso de un paciente con infecciones de repetición durante el periodo neonatal y una severa linfopenia T y B. Se realizó el diagnóstico de Déficit de ADA a través de un ensayo de actividad enzimática. Posteriormente, se realizó un trasplante alogénico de donante emparentado haploidéntico, con exitosa recuperación del sistema inmunológico. <br/>Analizamos un paciente varón con sospecha clínica de inmunodeficiencia humoral, con un número disminuido de células B e hipogammaglobulinemia. Por métodos bioquímicos se puso de manifiesto la falta de expresión de la proteína Btk. El análisis genético del gen BTK, mostró una nueva mutación (Q103X) que afectaba al dominio PH de la Btk, siendo diagnosticado de XLA con una correlación completa entre el genotipo, expresión proteica y fenotipo clínico. <br/>En los casos estudiados con Síndrome de Hiper IgM se descartó que fuesen formas debidas a alteraciones en las moléculas principales del eje CD40-CD40L. Encontramos ausente la población de células B memoria, analizando la expresión de IgM y CD27 en células B CD20+. Se realizó el estudio genético del gen AID, así como de las regiones constantes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, sin encontrar alteraciones. Estas características nos indican que el defecto en el cambio de isotipo podría encontrarse en este proceso tras la rotura del DNA y nos permite caracterizarlos dentro del grupo HIGM4.<br/>Se analizan los rasgos clínicos, inmunológicos y genéticos de once pacientes con sospecha de ALPS. Hemos descrito dos familias con mutaciones que afectan al residuo 234 de la proteína FAS, las cuales se correlacionan con una apoptosis vía Fas disminuida, con la presencia de células DNT y con una penetrancia clínica variable, lo que nos permite definirlas como ALPS tipo Ia. El resto de los pacientes, sin mutaciones en Fas, con alteraciones funcionales en la apoptosis vía Fas se clasifican en el grupo de ALPS III.<br/>Por último, se ha estudiado una población doble positiva (DP) en un paciente con patología respiratoria. Las características de la población indican que fenotípicamente se trata de una población T CD3+CD4+CD8+&#945;&#946;, que funcionalmente pertenece a la estirpe de células T colaboradoras CD4. La expresión de CD103 y de CCR6 en la población DP, y su presencia en el órgano diana de la enfermedad, justifican su tropismo a mucosa pulmonar y relacionan dicha población con la patología respiratoria. Aunque el paciente no presentó rasgos de malignidad, el análisis del repertorio V&#946; mostró reordenamientos clonales, que junto a las alteraciones cromosómicas sugerirían un estado preleucémico, que requeriría alteraciones adicionales para desarrollar un proceso neoplásico franco. <br/>Los resultados de esta Tesis muestran que la complejidad de las patologías que afectan al sistema inmunológico, requiere técnicas cada vez más específicas para determinar los defectos responsables de un fenotipo concreto. El estudio genético, molecular y funcional sistemático de estas enfermedades permite diagnosticar y clasificar entidades ya descritas, así como abordar el diagnóstico de nuevas patologías.

Although primary immunodeficiency disorders are relatively rare, intensive investigation of these disorders has yielded great understanding of basic immunologic mechanisms in host defense, inflammation, and autoimmunity. In this thesis we described the clinical and immunological features of patients with suspected of primary immunodeficiency disorders or lymphoproliferative syndromes. <br/>We assessed the NADPH oxidase activity in a patient with catalase-positive microbial infections, the results showed a deficiency in superoxide production. The mutation analysis of the structural component p47-phox revealed a GT deletion in a GTGT repeat sequence at the beginning of exon 2 of NCF1, with the subsequent diagnosis of Chronic granulomatous disease.<br/>We studied a patient with overwhelming infections within the first year of life and severely reduced counts of peripheral T and B cells. The patient had no detectable ADA activity associated with severe metabolic disturbances. He was treated with histocompatible bone marrow transplantation from haploidentical related donor, with successful recovery of the immunological system.<br/>We analyzed a patient with recurrent pneumonia characterized by low to undetectable levels of B cells and serum immunoglobulins. The expression of BTK protein was completely abolished in this patient evaluated by Western-blot. We described a novel mutation (Q103X) resulting in a premature stop codon, which encodes a deleterious truncated protein. We found a complete phenotype/genotype correlation in our XLA patient.<br/>We studied two patients characterized by very low IgG and IgA levels and normal or increased IgM diagnostic of Hyper-IgM syndrome. The CD154/CD40 pathway was analyzed discarding alterations. Mature class-switched CD27+IgM- memory B cells were profoundly diminished. The molecular analysis of AID and immunoglobulin heavy chains revealed no mutations. Although the molecular basis of these cases is still unknown, their clinical and immunologic findings have been well characterized.<br/>Several patients with clinical and immunological features of ALPS were analyzed. The molecular analysis of Fas gene showed two families with heterozygous mutations affecting different positions of 234 codon associated with increased &#945;&#946;-DNT cells and defective in vitro receptor-mediated lymphocyte apoptosis. Other patients in this study with a clinical syndrome of ALPS have been found to have a normal FAS gene with impaired in vitro apoptosis and were diagnosed of ALPS IIII.<br/>We report an adult male who had recurrent episodes of pulmonary infiltrates with severe acute respiratory failure over a period of ten years. Clinical and pathological characteristics revealed BOOP that responded dramatically to Prednisone and other immunosuppressor treatments. A high proportion of circulating double positive T (DP-T) cells was detected in peripheral blood and in bronchoalveolar lavage, the entire DP-T cell subset were to TCR&#945;&#946; CD3+CD4+CD8&#945;&#946;+ lymphocytes. The CD103 and CCR6 expression in DP-T cells could explain their tropism to lung tissue. The TCRV-&#946; chain analysis indicated clonal rearrangement and cytogenetic studies displayed chromosomic alterations that were similar to clonal proliferation observed in ataxia-telangiectasia and T-prolymphocytic leukemia. These findings suggest a smouldering form, in which the first sign is an organizing pneumonia that needs a constant corticoid treatment. <br/>Our results show that the complexity of pathologies that affect the immune system demand more specific techniques to determine the defects of a specific phenotype. The genetic, molecular and functional systematic analysis of these diseases allows a proper diagnosis and classification of known entities, and screen for undescribed pathologies.