Estudi del perfil proteic del plasma de pacients amb diferents graus d’hepatopatia: identificació de biomarcadors del carcinoma hepatocel·lular

Abstract

El carcinoma hepatocel.lular (CHC) és la principal causa de mort en pacients cirròtics. Per aquesta raó, aquests pacients s’inclouen en un programa de vigilància amb una ecografia semestral per tal de detectar el CHC en un estadi precoç, quan la curació és possible. Tot i això, només un 40% dels casos es diagnostiquen en un estadi inicial i la taxa de recidiva després del tractament curatiu (resecció quirúrgica o ablació percutània) és molt elevada. Per això, és tan important la identificació de biomarcadors serològics com a eina complementària per la vigilància i per tal de predir la recidiva tumoral després del tractament. L’objectiu principal d’aquesta tesi és l’anàlisi del perfil proteic del plasma de pacients cirròtics amb i sense CHC per identificar biomarcadors diagnòstic inicial de marcadors i malaltia disseminada. Es va analitzar el perfil proteic de 30 mostres de plasma de procedents de 12 pacients amb diferents graus d’hepatopatia crònica (fibrosi moderada n=3, cirrosi compensada Child Pugh A n=7, cirrosi descompensada Child Pugh B n=2), 15 pacients cirròtics amb CHC (BCLC 0/A, n=9; BCLC C/D amb trombosi portal tumoral i/o metàstasi n=6) i 3 voluntaris sans sense malaltia hepàtica. Es van deplecionar les 20 proteïnes majoritàries del plasma i abans de la digestió enzimàtica es va realitzar un pre-fraccionament del plasma amb electroforesi unidimensional. Posteriorment es va fraccionar la mostra per cromatografia líquida d’alta resolució acoblada a un espectròmetre de masses en tàndem per la seqüenciació peptídica (HPLC-MS/MS). Es va identificar un panel de 31 biomarcadors diagnòstic de CHC inicial al comparar el perfil proteic de mostres de pacients cirròtics amb CHC inicial vers pacients cirròtics sense CHC; i un panell de 41 biomarcadors de disseminació tumoral de CHC al comparar pacients amb CHC avançat vers CHC inicial. Es van detectar tres vies de senyalització activades a partir de l’anàlisi Ingenuity Pathway Analysis, observant una activació de la via de resposta aguda i de la via de producció d’òxid nítric en pacients amb CHC, i la via de senyalització LXR/RXR fortament activada relacionada amb la malaltia tumoral disseminada. A més les proteïnes plasmàtiques identificades en pacients amb CHC avançat disseminats van predir l’activació de MYC, VEGF, HGF i HNF1A com a reguladors upstream. És interessant destacar que el 79% del biomarcadors identificats ja s’han relacionat anteriorment en altres càncers i /o CHC. Finalment es van validar els nivells de 2 de 7 biomarcadors candidats seleccionats per la técnica enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). En conclusió, a partir de l’anàlisi proteòmic del plasma vam ser capaços d’identificar un panell de biomarcadors diagnòstic de CHC. Una vegada validats aquest marcadors en una cohort més àmplia independent, el panell proposat podrà utilitzar-se com una eina per millorar el maneig dels pacients amb CHC i així millorar la seva supervivència.

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the main cause of death in cirrhotic patients. For that reason, these patients are included in a surveillance program with abdominal ultrasonography twice per year to detect HCC at early tumour stages, when cure is highly likely. Nevertheless, only 40% of the cases are diagnosed at early stages and the HCC recurrence rate after curative treatment -surgical resection or percutaneous ablation- is very high. Therefore, the identification of biomarkers is needed to use them as complementary tools for surveillance and for predicting tumour recurrence after treatment. The main aim of this thesis is to perform proteomic profiling of the plasma of cirrhotic patients with and without HCC to identify diagnostic and invasiveness biomarkers. We analysed the protein profile of 30 plasma samples from 12 selected liver disease patients with different grade of fibrosis (mild fibrosis n=3, cirrhotic Child-Pugh A n=7 and Child-Pugh B n=2), 15 HCC patients (BCLC 0/A, n=9; BCLC C/D with portal thrombosis and/or metastasis, n=6) and 3 healthy voluntaries. Plasma samples were depleted of 20 most abundant interfering proteins fractionated by unidimensional electrophoresis and enzymatically digested, and peptides were analysed by liquid chromatography coupled with mass spectrometry (HPLC-MS/MS). We identified a panel of 31 early diagnostic biomarkers by comparing the plasma proteome of cirrhotic patients with early HCC versus those without HCC and a panel of 41 biomarkers related to tumour invasiveness HCC as compared to early cases. Pathway analysis of the differentially proteins by Ingenuity Pathway Analysis revealed vital canonical pathways involving acute phase response and nitric oxide production signalling and LXR/RXR activation specially in advanced HCC. Furthermore, differentially plasma proteins in advanced HCC suggest activation of MYC, VEGF, HGF and HNF1A as upstream regulators. Interestingly, 79% of identified biomarkers have been already reported in HCC and other cancer. Finally we validate the plasma levels of 2 out 7 biomarker candidates selected by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). In conclusion we have been able to identify a panel of diagnostic and prognostic biomarkers of HCC by plasma protein analysis. Once validated in an independent cohort, our plasma-based biomarker panels could be used as complementary tools to improve the clinical management of HCC patients.