Contingut i funció dels miRNAs de l’espermatozoide humà: implicacions reproductives

Abstract

Els miRNAs són molècules de 22-24nt implicades en la regulació de l’expressió gènica de nombrosos processos biològics. Alguns autors han identificat perfils d’expressió de miRNAs alterats en diversos casos d'infertilitat masculina i han suggerit que aquests poden estar associats a anomalies dels processos d’espermatogènesi i embriogènesi. Els objectius d’aquesta tesi van incloure: i) Optimitzar un mètode d’extracció del transcriptoma complert dels espermatozoides humans que inclogui els miRNAs; ii) Caracteritzar els perfils d’expressió de miRNAs en espermatozoides procedents d’individus fèrtils; iii) Caracteritzar els perfils de miRNAs en espermatozoides procedents de diferents poblacions d’individus infèrtils amb alteracions del seminograma; iv) Avaluar la relació entre els perfils obtinguts i les característiques del seminograma, l’edat, la incidència d’anomalies cromosòmiques en espermatozoides, i els resultats de les tècniques de reproducció assistida (TRA) dels individus estudiats; v) Identificar els miRNAs diferencialment expressats (DE-miRNAs) en les poblacions d’individus infèrtils, així com les seves dianes potencials i els gens continguts en les seves unitats de transcripció, per tal de valorar la possible afectació de processos relacionats amb l’espermatogènesi i embriogènesi. Es van obtenir mostres de semen de 14 individus fèrtils i 34 infèrtils. De tots ells es va recollir informació referent a l’edat i els paràmetres seminals. En els individus infèrtils, també es va obtenir informació en relació a la incidència d’anomalies cromosòmiques numèriques en espermatozoides i de les TRA a què es van sotmetre les parelles. Quatre mostres de semen de pacients fèrtils i quatre de pacients infèrtils es van utilitzar per desenvolupar un protocol d’obtenció d’RNA espermàtic total (inclosos els miRNAs). Aquest es va aplicar sobre les mostres restants: 10 individus fèrtils (població control) i 30 pacients infèrtils amb alteracions pures del seminograma (n=10 astenozoospèrmia, n=10 teratozoospèrmia, n=10 oligozoospèrmia). En tots ells es van analitzar els valors d’expressió de 736 miRNAs per qRT-PCR mitjançant la tecnologia TaqMan®. La població fèrtil va mostrar perfils d’expressió de miRNAs espermàtics altament homogenis, fet que indica una retenció no aleatòria d’aquestes molècules durant l’espermatogènesi. L’anàlisi d’ontologia gènica dels processos biològics associats a les dianes predites del miRNAs presents de forma ubiqua en els espermatozoides d’aquests individus va mostrar un enriquiment de funcions rellevants per la fertilitat, com són la diferenciació i desenvolupament cel·lular, la morfogènesi, i l’embriogènesi. La valoració de la similitud dels perfils d’expressió del conjunt de mostres analitzades va mostrar una classificació dels individus en dos grups clarament diferenciats que mostraven una associació amb el seminograma dels pacients. També es van observar miRNAs correlacionats amb motilitat, concentració espermàtica i l’edat dels individus. Per altra banda, es van identificar 57 DE-miRNAs en espermatozoides d’individus infèrtils: 32 DE-miRNAs en la població d’individus amb astenozoospèrmia, 19 DE-miRNAs en la d’individus amb teratozoospèrmia i 18 en la d’individus amb oligozoospèrmia. L’anàlisi de les dianes predites pels DE-miRNAs mitjançant ontologia gènica va mostrar un enriquiment de processos biològics relacionats amb l’embriogènesi i amb les alteracions seminals específiques presents en els individus analitzats.

MiRNAs are molecules of 22–24nt that have been shown to play an important role in many biological processes. Some authors have identified altered expression profiles in different cases of male infertility suggesting their participation in the processes of spermatogenesis and embryogenesis. The objectives of this Thesis were: i) To optimize a method for isolating the total human sperm transcriptome, including miRNAs; ii) To characterize the miRNA expression profile in spermatozoa from human fertile and infertile individuals; iii) To evaluate the relationship between expression profiles and seminal parameters, age, incidence of chromosome abnormalities, and the results of assisted reproductive techniques (ART) of the individuals analyzed; iv) To identify the differentially expressed miRNAs (DE-miRNAs) in each infertile population and their association to spermatogenesis and embryogenesis. Ejaculated samples from 14 fertile donors and 34 infertile patients were obtained. Information about age and sperm parameters was collected from all individuals. In infertile patients, data about the incidence of sperm chromosome abnormalities and ART outcome were also compiled. Four semen samples from fertile individuals and four form infertile patients were used to optimize a protocol to isolate total sperm RNA (including miRNAs). The optimized protocol was applied on 10 fertile individuals (control population), and 30 infertile patients with pure seminogram alterations (n=10 asthenozoospermic, n=10 teratozoospermic, and n=10 oligozoospermic). The expression levels of 736 miRNAs were analyzed by qRT -PCR using TaqMan® technology. The fertile population showed a highly homogenous miRNA expression profiles, supporting a non-stochastic retention of these molecules during spermatogenesis. The ontological analysis of the predicted target genes of the ubiquitous miRNAs present in sperm from these individuals showed an enrichment of essential processes for fertility such as cell differentiation and development, morphogenesis, and embryogenesis. In the evaluation of the similarity among miRNA expression profiles, all samples were distributed in two main clusters. This distribution showed a significant association with the seminogram. Moreover, some miRNAs correlated with individual’s age, sperm motility and sperm concentration. Infertile patients presented 57 DE-miRNAs: 32 DE-miRNAs in the asthenozoospermic population, 19 in the teratozoospermic population, and 18 in the oligozoospermic population. The ontological analysis of the predicted target genes of these DE-miRNAs revealed a significant enrichment of biological processes related the specific seminal alterations present in each group of individuals and embryogenesis.