Functionalizing artificial nerve guides to promote regeneration and recovery after peripheral nerve injuries

Abstract

Las lesiones severas de nervio periférico se caracterizan por la desconexión del soma neuronal con el órgano inervado. Esta desconexión causa una pérdida de control motor, sensitivo y autonómico que conducen a una situación incapacitante para el paciente. Después de una lesión el sistema nervioso periférico tiene la capacidad de regenerar, pero para ello se requiere de un proceso de limpieza en el fragmento distal a la lesión y la promoción de la regeneración a través del extremo proximal. En esta tesis hemos querido centrarnos en el papel de la matriz extracelular en la regeneración de nervio periférico. Para ello, en el primer capítulo nos hemos centrado en el papel de dichas proteínas en la promoción de regeneración selectiva de axones motores y sensoriales y si una matriz basada en colágeno resulta un vehículo adecuado para funcionalizar guías neurales artificiales para la reparación de lesiones nerviosas. Utilizamos un cultivo organotípico de secciones transversales de médula espinal y explantes de ganglio de la raíz dorsal de animales postnatales y contrastamos nuestros resultados con un modelo adulto in vivo. Nuestros resultados muestran que tanto las matrices enriquecidas con fibronectina o laminina incrementan la elongación de neuritas sensoriales mientras que las neuritas motoras solo respondían a las matrices enriquecidas con fibronectina, al compararlas con matrices controles de colágeno sin enriquecer in vitro. Además, en etapas postnatales las matrices enriquecidas con fibronectina promovían la regeneración específica de neuritas tanto motoras como sensoriales proprioceptivas, mientras que laminina actuaba sobre neuritas sensoriales cutáneas. Esta respuesta selectiva de las neuronas hacia proteínas de la matriz extracelular resulta importante para facilitar la organización de los axones regenerados hacia ramas musculares o cutáneas después de la lesión. Sin embargo, esta actividad preferencial mostrada se perdía en edad adulta. En segunda instancia buscamos la mejor alternativa quirúrgica al autoinjerto en la reparación de lesiones severas de nervio periférico. Nos centramos en mejorar la técnica de reparación por tubulización en un modelo crítico de regeneración de 15 mm en el nervio de rata, donde en general, la recuperación funcional, reinervación de órganos diana y el número de fibras mielínicas se ve comprometido con respecto al autoinjerto (todavía considerada como la mejor técnica en la práctica clínica). Los resultados muestran que la dificultad de los axones para regenerar en el interior de las guías neurales artificiales se relaciona con la capacidad limitada de dichos axones de crear un ambiente proregenerativo que les permita cruzar por el interior del lumen tubular. En el primer caso, la reparación con tubos de silicona resultó en un fracaso absoluto. Sin embargo, los tubos basados en quitosano, un material biodegradable y absorbible, mejoró el número de animales regenerados hasta porcentajes cercanos al 50%. A pesar de estos resultados esperanzadores, todavía nos encontrábamos lejos del 100% de éxito obtenido con el autoinjerto. Por ello, en el tercer capítulo, mejoramos el lumen tubular mediante la adición de las matrices enriquecidas con laminina o fibronectina estudiadas en el primer capítulo, tanto como hidrogeles hidratados como estabilizados. En este caso, el porcentaje de animales regenerados aumentó hasta un máximo del 75% en las matrices enriquecidas con fibronectina estabilizada. Con el objetivo final de imitar el ambiente regenerativo que encontramos en un fragmento distal de un nervio lesionado, en el último capítulo mejoramos el lumen tubular mediante la incorporación de células de soporte. Cultivamos células de Schwann y células madre mesenquimales y las integramos en matrices alineadas enriquecidas con fibronectina o laminina. Mediante la implementación de estas últimas matrices junto a la administración del agente inmunosupresor FK506, conseguimos obtener unos resultados similares a la reparación con autoinjerto.

Severe peripheral nerve injuries are characterized by the disconnection of the neural soma and the innervated organ. This disconnection causes the loss of motor, sensory or autonomic control which lead to a disabling situation for the patient. Regeneration can occur in the peripheral nervous system, but the clearance of the degenerated distal nerve and the promotion of regeneration of the proximal stump are needed to facilitate adequate reinnervation and functional recovery. In this thesis we wanted to focus in the role of the extracellular matrix (ECM) for peripheral nerve regeneration. For that in our first chapter we focused on the role of the ECM to promote selective regeneration of motor and sensory axons and if collagen-based scaffolds are suitable vehicles to functionalize artificial nerve conduits in limited peripheral nerve gaps. We used organotypic spinal cord slices and DRG explants of early postnatal and young adults animals, and we contrasted our results in the adult in vivo. Our results show that fibronectin and laminin enriched scaffolds increased the elongation of sensory neurites whereas motor neurites were more elongated in fibronectin compared to collagen-based scaffolds in vitro. Furthermore, in young postnatal stages, we were able to preferentially promote elongation of motor neurites and presumptive proprioceptive neurites on fibronectin-enriched matrices, whereas laminin increased the elongation of presumptive cutaneous sensory neurites. This is important, since neuron type preference towards specific extracellular matrix components may facilitate the organization of regenerating axons in muscular or cutaneous nerve branches. However, this preferential activity was gradually decreased and finally lost in the adult. Second, we searched for a feasible surgical alternative to autograft in the repair of severe peripheral nerve injuries. For that we focused in the improvement of the tubulization repair technique for the repair of severe peripheral nerve defects (15 mm in the rat), where the general outcome achieved by this repair technique (degree of recovery, functional reinnervation and number of regenerated fibers) is still inferior to the autograft, (considered the gold standard technique for the clinical practice) despite assuming the loss of a secondary healthy nerve. The results show that the greatest difficulty of axons to regenerate trough tubular devices is related to the limited capacity of injured axons to create an enabling environment that allows regeneration in the lumen of the tubular devices. In the first case, the repair with silicone conduits resulted in a complete failure during the regeneration process. However, the use of chitosan-based guides, a biodegradable and absorbable material, improved the number of regenerated animals to a percentage close to 50%. Although these promising results for a hollow conduit, the percentage of regenerated animals was still far from the 100% found in the autograft. For that reason, in our third chapter we led to the implementation of intratubular content by introducing fibronectin and laminin enriched collagen scaffolds added, both as fully hydrated hydrogels or stabilized and rolled. In this case, the percentage of animals that regenerated increased to a maximum of 75% in the fibronectin-enriched, stabilized and rolled hydrogels. With the ultimate goal of mimicking what is occurring in a healthy nerve or the distal fragment of a degenerated nerve, in the fourth chapter we decided to fully functionalize the lumen of the tube by incorporating support cells. We harvested and cultured Schwann cells and Mesenchymal Stem cells which were embedded in a tethered-aligned collagen-based construct enriched with either fibronectin or laminin and implanted to the animals. By implementing the latter matrices together with the coadjuvant administration of the immunosuppressant agent FK506, we achieved a degree of recovery comparable to the autograft model.