Aplicació de les tècniques de citogenètica molecular per a l'establiment d'associacions genotip-fenotip

Abstract

Avui dia encara són moltes les persones que consulten els Serveis de Genètica Clínica per presentar malformacions congènites i/o retard mental. En aquests casos, cal establir un bon diagnòstic genètic així com realitzar una bona exploració clínica, ja que la comparació dels trets presents en pacients amb alteracions cromosòmiques idèntiques o similars permetrà detectar les anomalies clíniques comunes i, per tant, establir les correlacions genotip-fenotip. <br/>En aquest treball s'han analitzat 145 mostres de pacients que presentaven malformacions congènites i/o retard mental i infertilitat i amb un cariotip normal o anormal sense acabar de ser caracteritzat per citogenètica convencional. Les 145 mostres s'han dividit en cinc grups: GRUP A: 90 pacients amb cariotip normal i quadre clínic; GRUP B: 8 barons 46,XX; GRUP C: 10 pacients portadors d'anomalies cromosòmiques "aparentment" equilibrades; GRUP D: 18 pacients amb monosomies o trisomies parcials i el GRUP E: 19 pacients amb cromosomes marcador.<br/>S'han aplicat tècniques d'extracció d'ADN, de cultiu cel·lular, i d'obtenció d'extensions metafàsiques per analitzar les mostres. Amb l'ADN extret, s'han aplicat les tècniques de MLPA (P036B, P070, P106-B1), de CGH/HR-CGH (Nick translation kit) i d'aCGH (qChip Post de 60000 clons i xip de 19000 clons). A partir de les extensions metafàsiques, s'han aplicat diferents tècniques de FISH: locus específica, pintat cromosòmic, sondes de cromosomes artificials de bactèries, multipintat, multicolor centromèrica i de bandeig multicolor.<br/>L'aplicació d'una bateria de tècniques de citogenètica molecular ha permès confirmar la presència d'anomalies cromosòmiques al 7.8 % dels pacients del grup A i s'ha proposat un protocol d'actuació en un laboratori de diagnòstic clínic per aquest tipus de pacients. Respecte al grup B, s'ha evidenciat l'existència d'heterogeneïtat de material corresponent a la regió pseudoautosòmica XPAR1 que podria contribuir a la variabilitat fenotípica que presenten els barons 46,XX,SRY+. Pel que fa als resultats obtinguts al grup C, s'ha caracteritzat amb més precisió l'anomalia cromosòmica al 55% dels casos. L'estudi del grup D ha permès caracteritzar l'origen cromosòmic implicat en les diferents anomalies en tots els casos. A més, s'ha confirmat l'anomalia detectada per CGH/HR-CGH al 78 % dels casos i la FISH amb sondes BAC ha permès redefinir els punts de trencament implicats en l'anomalia cromosòmica en tots els casos en què ha estat aplicada. Finalment, respecte al grup E, la combinació de diferents tècniques de citogenètica molecular ha permès una identificació de l'origen del sSMC al 94.7% dels pacients. S'ha proposat també un protocol d'actuació en un laboratori de diagnòstic clínic i s'ha vist que l'origen cromosòmic més comú del marcador ha estat el cromosoma 15 (10 casos), seguit del cromosoma 8 (3 casos), 13/21 ó 14/22 (2 casos) i dels cromosomes 2 , 7 , 9 i 22 (1 cas).<br/>Paral·lelament, l'anàlisi dels punts de trencament implicats en les diferents anomalies cromosòmiques estudiades , ha revelat que la seva distribució al genoma no és a l'atzar, ja que la majoria es localitzen en les bandes clares (un 61%), que corresponen a regions amb major densitat gènica. També, que majoritàriament els punts de trencament coincideixen amb bandes riques en duplicacions segmentàries (DSs) i en regions on s'han descrit variacions en el número de còpies (CNVs) (un 83% i un 94% respectivament). A més a més, cap de les regions CNVs implicades als casos que presentaven un fenotip normal havia estat associada a alguna síndrome clínica a la literatura, mentre que entre el 18% i el 25% de les regions CNVs implicades en els punts de trencament dels pacients amb anomalies cromosòmiques i fenotip alterat, sí que havien estat associades a síndromes clíniques segons la literatura.

Nowadays there are many people who consult The Genetic Clinical Services because of congenital malformations and/or mental retardation. In these cases, it is essential to make a proper genetic diagnosis as well as a good clinical exploration in order to establish accurate genotype-phenotype associations.<br/>145 samples from patients presenting congenital malformations and/or mental retardation and infertility with a normal or an abnormal karyotype have been studied in this work. These samples have been classified in 5 different groups. Group A: 90 patients with a normal karyotype and clinical manifestations; Group B: 8 46,XX males; Group C: 10 patients with apparently balanced chromosomal abnormalities; Group D: 18 patients with partial monosomies or trisomies and Group E: 19 carriers of supernumerary marker chromosomes (sSMC).<br/>DNA extraction protocols, cell culture and metaphase spreads have been applied in order to analyze all these samples. MLPA (P036B, P070, P106-B1 kits), CGH/HR-CGH (Nick translation kit) and/or aCGH (qChip Post of 60000 clones and a chip of 19000 clones) techniques were applied from extracted DNA. To confirm these results, different FISH techniques (MFISH, cenMFISH and subcenMFISH) have been used over metaphase spreads.<br/>The use of a variety of molecular cytogenetic techniques has allowed the identification and confirmation of chromosomal anomalies in 7.8% of the patients from group A. Besides, a protocol of proceedings has been suggested to use in private clinical laboratories in such cases. In reference to group B, this battery has shown that the pseudoautosomal region XPAR1 can be very heterogeneous in these patients, and this heterogeneity might contribute to the phenotypic variability of 46,XX,SRY+ males. Referring to group C, a more accurate identification of the chromosomal anomaly has been obtained in 55% of cases. The study of patients from group D has allowed the identification of the chromosomal origin of the anomaly in all the cases. The CGH/HR-CGH results have been confirmed in 78% of these patients. Besides, FISH with BAC probes has demonstrated to be a very useful tool in order to identify the break points involved in all the chromosomal anomalies analyzed. Finally, in reference to group E, this battery of techniques has allowed the identification of the origin of SMC in 94.7% of cases. Another protocol of proceedings has been suggested to use in private clinical laboratories in such cases. The marker chromosomes more frequently analyzed in this work derived from chromosomes 15 (10 cases), 8 (3 cases), 13/21 or 14/22 (2 cases) and 2, 7, 9 and 22 (1 case each).<br/>On the other side, the analysis of all the break points involved in the chromosomal anomalies studied in this series of patients has revealed that their distribution along the human genome is not random, since the 61% were located in white bands, which are gene-rich. Besides, they do also tend to locate in DSs-rich bands and in regions where CNVs have been described (83% and 94% respectively). Furthermore, none of the CNVs involved in phenotypic normal cases had been described as pathogenic previously , whereas over the 18%-25% of the CNVs identified at the break points in patients with an abnormal phenotype had been associated with clinical syndromes according to the literature.