Conserved hemagglutinin peptides of influenza virus as potential multivalent vaccine candidate: characterization of immune response in different animal models

Abstract

Los virus de influenza A (IAVs) son los responsables de brotes pandémicos y de la mayoría de las epidemias anuales en los seres humanos, aves y cerdos. Los virus de influenza A se dividen en subtipos, basado en la naturaleza de sus glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA es una glicoproteína de superficie homotrimérica que media la entrada del virus de influenza a través de la unión celular y eventos de fusión de membranas. El bolsillo de unión al receptor de HA está rodeado por los sitios de unión de anticuerpos antigénicamente variables. Por lo tanto, los anticuerpos limitados a estos sitios debería, en principio, bloquear la unión a las proteínas del receptor, inhibiendo la entrada del virus, lo que demuestra actividad de inhibición de la hemaglutinina y la actividad de neutralización viral. Sin embargo, la subunidad 1 de HA (HA1) es altamente variable a través de los virus de influenza y tiende a cambiar bajo presión inmune; por lo tanto, fácilmente evade los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacunación o infecciones anteriores. Las consecuencias negativas de las infecciones por virus de influenza incentivan al mundo de la ciencia para promover el desarrollo de vacunas multivalentes contra la gripe, que tengan eficaz protección frente a todas las cepas de influenza. Por consiguiente, el campo de la bioinformática se ha convertido en una parte importante de la identificación y validación temprana de nuevas dianas terapéuticas que podrían ser un primer paso esencial en el desarrollo de una vacuna eficaz para el virus de influenza, que representa la alta variabilidad de sus determinantes antigénicos.

En esta tesis se postuló que la HA1 podría representar una diana potencial para una vacuna multivalente frente a la infección por influenza virus. Por ende; el objetivo general de esta tesis fue seleccionar péptidos conservados de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe, para evaluar la eficacia de los candidatos seleccionados, para inducir la inmunidad que pueda proteger a los animales contra la infección. Para desarrollar este objetivo, se llevaron a cabo tres estudios experimentales: en ratones (Capítulo 1), cerdos (capítulo 2) y pollos (Capítulo 3).

En el primer estudio, se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos HA1 contra la pandemia del virus H1N1 2009 (pH1N1) y el virus de la influenza de alta patogenicidad H7N1 en un modelo de ratón (Capítulo 1). En este estudio, los ratones fueron vacunados por vía intraperitoneal con la mezcla de péptido sintético (NG34 + DC89) y desafiados ya sea con el pH1N1 ó H7N1 del virus de influenza. Una mortalidad del 85% fue observada en los ratones de control, independientemente del virus utilizado para el desafío, 80% y 66% de los ratones vacunados con péptido sobrevivieron al desafío con pH1N1 y H7N1, respectivamente, sin la detección de virus de la influenza (IV). Los ratones vacunados supervivientes se correlacionaron con la presencia de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada en sueros antes de la exposición. La inmunización con NG34+DC89 también indujo respuesta inmune en mucosas; demostrándose con la presencia de IgA en lavado broncoalveolar en el 50% de los animales. Nuestros resultados también muestran que la vacunación de NG34+DC89 es capaz de inducir anticuerpos y la protección cruzada neutralizante frente a dos cepas heterólogas, pH1N1 y H7N1. Por lo tanto, péptidos NG34+DC89 representan un inmunógeno atractivo, lo que podría ser aún más optimizado para futuras formulaciones de vacunas multivalentes frente el virus de influenza.

En el segundo estudio, hemos probado la inmunogenicidad de un cóctel HA1-péptido en un modelo porcino para evaluar si esta nueva formulación puede conferir inmunidad a una amplia gama de virus de influenza in vitro (Capítulo 2). En este estudio, hemos utilizado cuatro péptidos de la HA1 del subtipo H1 del virus de influenza (NG34, DC55, RA22 y SS35), evaluamos su inmunogenicidad en cerdos convencionales de granja frente a virus de influenza homólogos y heterólogos. Las vacunas de péptidos sintéticos indujeron anticuerpos con capacidad neutralizante y de inhibición frente a virus homólogos. Aquellos también cros-reaccionaron frente a los virus heterólogos de origen aviar como el virus H7N1 y virus de influenza de baja patogenicidad H5N2 y además el virus circulante H3N2 de origen porcino. Por otra parte, se detectaron anticuerpos específicos de IgA-secretora en hisopos nasales. Los resultados muestran que los péptidos evaluados fueron inmunogénicos en cerdos. La respuesta humoral con la actividad neutralizante y de inhibición de hemaglutinina generada después de la inmunización podría ser utilizada en otros estudios de inmunidad protectora heterosubtípica.

En el tercer estudio se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos de HA1 contra el virus altamente patógeno virus de la influenza H7N1 en pollos, un modelo huésped natural (capítulo 3). En este estudio, se utilizaron dos péptidos sintéticos NG34 y SS35 para vacunar pollos de granja. La vacunación tanto con péptidos NG34 ó SS35 indujeron anticuerpos específicos que reconocen virus heterólogos, como H7N1 y H5N2 in vitro. La vacunación con péptido NG34 provocó una respuesta de anticuerpos protectores que confirió una protección parcial frente un desafío letal con H7N1. Además, el péptido NG34 indujo una respuesta inmune de la mucosa, que correlacionaba con la diseminación viral reducida en hisopos orofaríngeos/ cloacales y la pulpa de la pluma. Por el contrario, animales vacunados con el péptido SS35 no pudieron producir una eficiente respuesta inmune protectora frente el desafío letal H7N1.

Es necesario recalcar, que todos los péptidos HA1 del subtipo H1 del virus de influenza, fueron seleccionados mediante el Método de espectros informativo (ISM).

Cuatro principales conclusiones generales pueden extraerse de estos estudios: (i) Péptidos HA1 son inmunogénicos en todos los modelos animales estudiados (ratones, cerdos y pollos) e inducen una respuesta immune humoral y de mucosa. (ii) Péptidos inmunogénicos de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la influenza confieren una protección parcial contra diferentes subtipos virales en ratones; (iii) Los cerdos vacunados con péptidos HA1 provocan una respuesta de anticuerpos neutralizantes con actividad de inhibición de la hemaglutinina frente a diferentes subtipos de Influenza A virus y (iv) Péptidos HA1 confieren una protección parcial contra un virus altamente patógeno/ H7N1 en modelo de pollo. En general, nuestros resultados proporcionan ideas sobre nuevos enfoques para la vacunación de la gripe y la comprensión de la respuesta inmune frente al virus de influenza en ratones, cerdos y pollos.

Influenza A viruses (IAVs) are responsible for pandemic outbreaks of influenza, and for most of the well-known annual flu epidemics, in humans, poultry and pigs. IAVs are divided into subtypes, based on the nature of their surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). The HA is a homotrimeric surface glycoprotein that mediates influenza viral entry via cellular attachment and membrane fusion events. The receptor-binding pocket of HA is surrounded by antigenically variable antibody binding sites. Therefore, antibodies bounded to these sites should, in principle, block the binding to receptor proteins, inhibiting viral entry, demonstrating hemagglutinin inhibition activity and viral neutralization activity. However, the subunit 1 of HA (HA1) is highly variable across viruses and tends to change under immune pressure and, hence, easily evades the neutralizing antibodies induced by previous vaccinations or infections. The negative implications of influenza virus infections push the world to promote the development of multivalent flu vaccines that protect against all human influenza strains. Therefore, the field of bioinformatics has become a major part of the identification and early validation of new therapeutic targets and could be an essential first step in the development of an effective vaccine for influenza virus that represents the high variability of its antigenic determinants.

Therefore, in this thesis it was postulated that the HA1 could represent a potential target for a multivalent vaccine of influenza infection. Consequently, the general objective of this thesis was to select conserved peptides from the HA1 of influenza viruses and to evaluate the efficacy of the selected candidates to induce immunity that can protect animal against infection. To achieve this objective, three studies were undertaken in mice (Chapter 1), pigs (chapter 2) and chickens (Chapter 3).

In the first study, we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against the pandemic H1N1 2009 virus and a H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in a mouse model (Chapter 1). In this study, mice were intraperitoneally vaccinated with the peptide mix (NG34+DC89), and next challenged with either the pH1N1 or the H7N1 strain of Influenza virus. Conversely to the 85% mortality observed in control mice, independently of the virus used for challenge, 80% and 66% of the peptide-vaccinated mice survived the challenge with pH1N1 and H7N1, respectively, without detection of influenza viruses (IV). Vaccinated mice surviving correlated with the presence of cross-reactive neutralizing antibodies in sera prior to challenge. The immunization with NG34+DC89 also induced mucosal immune responses demonstrated with the presence of IgA in bronchoalveolar lavage in 50% of the animals. Our results also show that NG34+DC89 is capable to induce cross-neutralizing antibodies and protection against two heterologous IV, pH1N1 and H7N1. Thus, NG34+DC89 represent an attractive immunogen, which could be further optimized for future multivalent vaccine formulations against influenza virus.

In the second study, we tested the immunogenicity of a HA1-peptide cocktail in a pig model to assess whether this new formulation can confer immunity to a wide range of IAVs in vitro (Chapter 2). Four peptides (NG34, DC55, RA22 and SS35) within the HA1 from H1 viruses were selected, and evaluated their immunogenicity in conventional farm pigs against homologous and heterologous viruses of influenza. Peptides immunizations induced HA neutralizing and inhibiting antibodies against homologous viruses. Those also cross-reacted against heterologous viruses like H7N1 and H5N2 and, most importantly, the circulating H3N2. Moreover, secretory IgA-specific HA antibodies in nasal swabs were detected. Altogether, the results show that the peptides tested were immunogenic in pigs. The humoral response with hemagglutinin-inhibiting and cross-neutralizing activity generated after immunization could be used in further studies of protective heterosubtypic immunity.

In the third study we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in chickens, a natural host model (Chapter 3). In this study, based on ISM, we selected two highly conserved peptides (NG34 and SS35) of a H1 influenza virus strain and used them to vaccinate free-range chickens. The vaccination with both NG34 and SS35 peptides induced specific antibodies that recognized heterologous viruses, as H7N1 HPAIV and H5N2 Low pathogenic avian virus (LPAIV) in vitro. Vaccination with NG34 peptide elicited a protective antibody response that conferred partial protection against a lethal challenge with H7N1 HPAIV. Furthermore, NG34 peptide induced a mucosal immune response, which correlated with reduced viral shedding in oropharyngeal/cloacal swabs and feather pulp. On the contrary, SS35 peptide vaccinated animals failed to produce an efficient protective immune response as no survival against lethal H7N1 challenge was achieved.

Finally, it remains to point out that all HA1-peptides from H1 subtype of influenza virus were selected by the method of informative spectra (ISM).

Four main general conclusions can be drawn from these studies: (i) HA1-peptides are immunogenic in all the animals models tested (mice, pigs and chickens) and induce humoral and mucosal immune response. (ii) Novel conserved immunogenic peptides from the hemagglutinin subunit 1 protein of influenza viruses confer partial protection against different viral subtypes in mice; (iii) Pigs vaccinated with HA1 peptides elicit neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibody responses against different subtypes of Influenza A virus and (iv) Synthetic peptides from the hemagglutinin of influenza viruses confer partial protection against highly pathogenic A/H7N1 virus in a free-range chicken model. Overall, these data provide insights on new approaches for vaccination in influenza and understanding of the immune response against influenza viruses in mice, pigs and chickens.