Análisis funcional de la región promotora de los genes recA y uvrA de Paracoccus denitrificans

Abstract

Hace mucho tiempo que se conoce la existencia en Escherichia coli de un sistema multigénico que responde a las lesiones en el DNA. Este sistema, conocido como sistema SOS no es exclusivo de esta especie bacteriana. Se han descrito sistemas similares no solamente en muchas otras especies de bacterias gramnegativas sino que también en especies grampositivas, siendo Bacillus subtilis el referente en estas últimas.<br/>El objetivo de esta tesis ha sido ahondar en el conocimiento de la regulación del sistema SOS dentro del grupo a de las Proteobacterias. Para conseguir nuestro objetivo hemos estudiado la regulación de los genes recA y uvrA de Paracoccus denitrificans y Rhodobacter capsulatus.<br/>En primera instancia procedimos a aislar, secuenciar y caracterizar el gen recA de P. denitrificans, gracias a una sonda derivada del gen recA de Rhodobacter sphaeroides. Posteriormente obtuvimos una cepa RecA- de P. denitrificans. También aislamos y secuenciamos la región operadora y el extremo 5' de la región codificante del gen uvrA de P. denitrificans, mediante hibridación con un fragmento interior del gen uvrA de R. sphaeroides. Para asegurarnos de que el gen uvrA de P. denitrificans formaba parte del sistema SOS de dicho microorganismo comprobamos su capacidad de inducción frente a lesiones en el DNA.<br/>El estudio de las regiones operadoras de los genes recA y uvrA, tanto in vitro mediante análisis de movilidad electroforética, como in vivo mediante el análisis de la inducción de fusiones con el gen lacZ de E. coli, nos ha permitido identificar el motivo GTTCN7GTTC como la caja SOS de P. denitrificans. La presencia de este motivo es necesaria para la unión de un represor, análogo al LexA de E. coli.<br/>Así mismo, y dado que el gen recA de R. capsulatus ya había sido secuenciado en nuestro laboratorio con anterioridad, nos centramos en el aislamiento y secuenciación del gen uvrA de esta especie bacteriana mediante una sonda obtenida a partir del gen uvrA de R. sphaeroides. Una vez dispusimos de la secuencia operadora y del extremo 5' de la región codificante de este comprobamos su inducibilidad frente a lesiones en el DNA.<br/>El estudio in vivo de la región operadora de estos dos genes pertenecientes al sistema SOS de R. capsulatus se llevó a cabo mediante fusiones con el gen lacZ de E. coli. En este caso también se comprobó que la caja SOS de R. capsulatus responde al motivo GTTCN7GTTC.<br/>Los resultados obtenidos en este trabajo así como los estudios previos realizados en nuestro laboratorio sobre el sistema SOS de R. sphaeroides y de la familia Rhizobiaceae nos permiten afirmar que el motivo GTTCYYYTTTTGTTC es la secuencia consenso para la caja SOS del grupo a de las Proteobacterias. Este es el primer caso en el que se describe una caja SOS cuya secuencia no es palindrómica.<br/>Los siguientes artículos describen y discuten los resultados en los cuales está basado este trabajo. En el texto se identifican con números romanos.<br/>I. Fernández de Henestrosa, A. R., del Rey, A., Tarragó, R. y Barbé, J. 1997. Cloning and characterization of the recA gene of Paracoccus denitrificans and construction of a recA-deficient mutant. FEMS Microbiol. Lett. 147: 209-213.<br/>II. del Rey, A., Diestra, J., Fernández de Henestrosa, A. R. y Barbé , J. 1999. Determination of the Paracoccus denitrificans SOS box. Microbiology 145: 577-584.<br/>III. Labazi, M., del Rey, A., Fernández de Henestrosa; A. R. y Barbé, J. 1999. Consensus sequence for the Rhodospirillaceae SOS operators. FEMS Microbiol. Lett. 171: 37-42.

In Escherichia coli, a multigenic system induced by DNA damage is well known. This system is called the SOS system. Similar systems have been reported in other bacteria, either Gramnegative and Grampositive (specially well studied in the case of B. Subtilis).<br/><br/>This thesis tries to deep the knowledge of the regulation of the SOS system in the a-Subclass of the Proteobacteria. We have studied the regulation of the recA end uvrA genes of Paracoccus denitrificans and Rhodobacter capsulatus.<br/><br/>First of all we have cloned, sequenced and characterised the recA gene of P. denitrificans, using a labelled probe containing the recA gene of Rhodobacter sphaeroides. After that, we constructed a recA-deficient mutant P. denitrificans strain. We also isolated and got sequenced the 5' end coding region and the promoter of the uvrA gene of P. denitrificans, probing a P. denitrificans genebank with an internal fragment of the R. sphaeroides uvrA gene. To be sure that the P. denitrificans uvrA gene was a member of the P. denitrificans SOS system, we studied its capacity to be induced by DNA damage.<br/><br/>The study of the recA and uvrA genes promoter region in vitro, with the electrophoretic mobility, and in vivo, with fusions between both promoters and E. coli lacZ gene, has allowed us to identify the motive GTTCN7GTTC. This motive is necessary for the binding of the repressor, similar to the E. coli LexA protein.<br/><br/>The recA gene of R. capsulatus have been previously sequenced in our laboratory. We isolated the uvrA gene of this microorganism with a R. sphaeroides uvrA gene labelled probe. We got the 5' ending region and the promoter. We proved that the uvrA gene from R. capsulatus was DNA-damage-inducible.<br/><br/>The in vivo studies of the promoter region of this two genes from the SOS system of R. capsulatus was carried out with fusions with the E. coli lacZ gene. We proved that the GTTCN7GTTC was also the R. capsulatus SOS box.<br/><br/>In our laboratory, other members of the a-Subclass of the Proteobacteria have been studied. This works allowed us to define the GTTCYYYTTTTGTTC as the consensus sequence for the a-Subclass of the Proteobacteria SOS box. Is the first SOS box described that is a direct repeat and not a palindrome.