Mejora de la producción del virus de la hepatitis A mediante selección genómica y cruce molecular de cuasiespecies

Abstract

El virus de hepatitis A (HAV), un virus de transmisión fecal-oral, contiene un genoma de RNA de cadena sencilla y sentido positivo, cuya longitud es de 7.5 kilobases aproximadamente y que codifica para un único marco de lectura abierto. Este virus replica ineficientemente en cultivo celular. Por ello, la producción de lotes del HAV a escala industrial destinados a vacunas o kits de diagnóstico resulta muy cara. El fenotipo de lenta replicación del HAV puede explicarse por tres factores clave interrelacionados. Primero, el sitio interno de entrada del ribosoma (IRES) es muy ineficiente dirigiendo la traducción. Segundo, el virus es incapaz de inhibir la síntesis de proteínas celulares. Por último, presenta un uso de codones altamente deoptimizado. En este trabajo se han aplicado a las cuasiespecies víricas conceptos procedentes la selección genómica, como parte de un proceso de “mejora vírica”. La selección genómica se basa en el uso de información genómica para predecir los valores de cría para características fenotípicas particulares. Con el objetivo de obtener una población del HAV de replicación rápida, utilizamos como material de partida dos poblaciones del virus que presentaban cambios en su uso de codones, obtenidas tras adaptar la cepa HM-175/43c a replicar en presencia de moderados y altos niveles de silenciamiento celular. La predicción de los “valores de cría” o mejora de productividad de estas poblaciones se realizó mediante secuenciación masiva ultra-profunda de dos fragmentos genómicos (parte de la región 5’NCR y la región codificante de la proteína VP1). En una de las dos poblaciones se detectaron individuos minoritarios con tres mutaciones en el IRES que le conferían una actividad significativamente superior. Por otro lado, en la misma población una minoría de los individuos mostraba cambios en algunos codones de la región codificante de VP1 que se asociaron a una mayor actividad traduccional. Para favorecer la amplificación de la fracción minoritaria de variantes con un alto “valor de cría” estimado, se siguió una doble estrategia. Por una parte, se realizó el cruce molecular de las dos poblaciones que habían sido estudiadas. Por otra parte, como la selección de los individuos minoritarios podría depender de las condiciones de multiplicidad de infección, se usó una MOI baja. Como resultado, se consiguió seleccionar una población con un fenotipo de rápido crecimiento y mayor productividad que las poblaciones de partida y, por tanto, de un gran valor añadido desde un punto de vista biotecnológico.

Hepatitis A virus (HAV) contains a single-stranded positive RNA genome of approximately 7 kb coding for a single open reading frame [ORF]) and is transmitted through the fecal–oral route. HAV grows very slowly in cell culture. For this reason, the production of viral antigen in large quantities for vaccines or diagnostic kits is expensive. The slow replication phenotype of HAV may be explained by three interrelated key factors. Firstly, HAV Internal Ribosome Entry Site (IRES) shows a very low efficiency in directing translation. Secondly, HAV is unable to induce cellular shutoff. Thirdly, HAV codon usage is highly deoptimized.

In this work, we applied genomic selection concepts to viral quasispecies, as part of a process of “viral breeding”. Genomic selection is based on the use of genomic information to predict breeding values for particular phenotypes. Aiming to obtain a rapidly replicating HAV population, we screened two viral populations searching for individuals with higher than the average estimated breeding values. A minority of individuals in one population showed a significantly more active IRES. Furthermore, a fraction of individuals from the same population held some codon changes associated with a faster translation speed.

A dual strategy was followed in order to facilite the amplification of the minor variants with higher estimated breeding values. On the one hand, both studied populations were mixed. On the other hand, as the selection of minority individuals may depend on the multiplicity of infection, a low MOI was used. As a result, a population with a faster growth and higher productivity phenotype was selected.