Caracterización de los mecanismos de captación de hierro de Pasteurella Multocida

Abstract

Los objetivos de la presente tesis doctoral han sido la caracterización de los mecanismos de captación de hierro de Pasteurella multocida, con el fin de contribuir al diseño de una vacuna contra este patógeno basada en la sobreexpresión de proteínas de membrana externa, receptoras de hemoglobina y/o hemina, o en la expresión constitutiva de las proteínas de membrana reguladas por hierro (IROMPs).<br/>Se ha identificado el gen fur de P. multocida y se ha estudiado el perfil electroforético de las proteínas de membrana externa de dicho patógeno, descubriéndose un control de la expresión de una proteína mayoritaria de membrana (OmpH) por parte de la proteína Fur. Se ha construido un mutante fur y se ha demostrado que la mutación de este gen no presenta ningún efecto sobre la virulencia de la cepa.<br/>Así mismo, se ha caracterizado la región cromosómica de P. multocida que contiene los genes exbB, exbD y tonB, detectándose la existencia de promotores internos en dicha región y por lo tanto la expresión independiente de cada uno de los tres genes del sistema. Se ha estudiado la regulación de la expresión de todos ellos, demostrándose que pertenecen al regulón Fur, y se han construido mutantes en los genes exbB, exbD y tonB. Se ha calculado la dosis letal 50 (DL50) de cada una de las cepas construidas, determinándose que cada uno de estos genes es imprescindible para el desarrollo normal de una infección por P. multocida, ya que en todos los casos se obtuvo un incremento de la DL50 superior a los tres órdenes de magnitud con respecto la cepa salvaje.<br/>Por otro lado, se ha analizado el genoma de P. multocida Pm70 y se han estudiado 9 proteínas que, por similitud con los receptores descritos en el banco de datos, podrían actuar como receptores de hemoglobina y/o hemina. Así se ha podido determinar que algunas de ellas son capaces de unir hemoglobina y hemina (PM0040, PM0236, PM0300, PM0741, PM1081 y PM1428), mientras que otras tan sólo interaccionan con la hemoglobina (PM0576) o la hemina (PM1282), y que otra (PM1078) no reconoce ninguna de estas fuentes de hierro.<br/>De entre todas estas proteínas se ha elegido la PM0300, que se ha denominado HgbA, para realizar un estudio más detallado de este tipo de receptores de membrana. Así, se ha demostrado que el gen hgbA forma una unidad transcripcional con los genes PM0298 y PM0299. Estos genes presentan similitud con hugX y hugZ de Plesiomonas shigelloides respectivamente, y están implicados en procesos de detoxificación de hierro. Se ha demostrado que, en P. multocida, las proteínas PM0298 y PM0299 son esenciales para la viabilidad de la cepa. Por otro lado, se ha determinado que el gen hgbA se expresa en las primeras dos horas de la infección y que, in vitro, su expresión se induce en ausencia de hierro. Además, se ha construido un mutante deficiente para esta proteína y se ha comprobado que no presenta disminuida ni su capacidad de unir hemoglobina in vitro ni su virulencia. Por otro lado, se ha comprobado la distribución prácticamente universal de este gen en cepas de P. multocida de distintos serotipos y orígenes animales, hecho que propone a esta proteína como candidata para el desarrollo de un método de identificación rápido y específico de este microorganismo.<br/>Por último, se ha analizado la capacidad inmunogénica y protectora de los receptores de hemina y/o hemoglobina. Así, se ha demostrado que por lo menos tres de estas proteínas (PM0236, PM0741 y HgbA) son inmunogénicas. Sin embargo, la inoculación en ratones de las proteínas HgbA y PM0741, ya sea de forma individual o conjunta, no induce protección ante un enfrentamiento homólogo.

In the present work, the Pasteurella multocida iron uptake mechanisms have been characterised. These results could be use to the obtention of one vaccine against this pathogen. <br/>The P. multocida fur gene has been identified and it has been demonstrated that the porine OmpH is under the control of the Fur protein. On the other hand, a P. multocida Fur mutant was constructed and its LD50 was calculated demonstrating that a mutation in this gene has no effect in the virulence of the strain.<br/>Moreover, the region which contains P. multocida exbB, exbD and tonB genes has been characterised. The results obtained demonstrate that these three genes do not constitute a single transcriptional unit, but all these genes possess its own promoter which is under the Fur-Fe(II) regulation. It has been obtained a ExbB, ExbD and TonB mutants and these mutants present a decrease in their virulence to increase their LD50 by more than three orders of magnitude when were inoculated via intraperitoneal. These data demonstrate that exbB, exbD and tonB genes are essential to P. multocida infectious process.<br/>Furthermore, the P. multocida Pm70 genome was analysed and nine putative haemin and haemoglobin-binding proteins have been identified by similarity with the same molecules of other bacterial pathogens. Quantitative binding assays have demonstrated that PM0040, PM0236, PM0300, PM0741, PM1081 and PM1428 bind both haemin and haemoglobin, whereas PM0576 and PM1282 only bind either haemoglobin or haemin, respectively. PM1078, despite presents similarity with a Yersinia enterocolitica haemin receptor, does not recognize none of these iron sources.<br/>PM0300 was named hgbA and it has been demonstrate that this gene and the PM0298 and PM0299 ORFs, which present similarity with hugX and hugZ of Plesiomonas shigelloides, respectively, constitute a single transcriptional unit. PM0298 and PM0299 are essential to the viability of P. multocida cells. The hgbA gene is expressed in vivo within the two first hours post-inoculation, and in vitro is repressed by iron. Moreover, a HgbA mutant binds haemoglobin to the same extent as the wild-type strain and, in agreement with this, virulence of the P. multocida hgbA cells was no affected. On the other hand, the hgbA gene is present in almost all the strains of P. multocida analysed, independently of their serotype or their animal source. This result propose hgbA as a putative candidate to develop a fast and specific method to identify this pathogen.<br/>Finally, the immumogenicity and the ability to induce protection of all these haemin and haemoglobin receptors were analysed. The results obtained have demonstrated that, despite PM0236, PM0741 and HgbA are immunogens, inoculation of mice with any single one of these binding proteins alone is not protective against P. multocida infection.