In vitro rodent models as alternative methods in assessing cytotoxicity and carcinogenic potential of metal compounds

Abstract

Los ensayos in vitro de transformación celular abarcan el proceso multifásico que va desde la conversión neoplásica hasta el establecimiento del fenotipo tumorigénico. En la presente tesis doctoral, el ensayo in vitro Balb/3T3, con una línea celular inmortalizada de fibroblastos de ratón, ha sido aplicado para determinar la citotoxicidad y el potencial carcinogénico de una serie de compuestos metálicos seleccionados por su interés ambiental, laboral y biomédico, adoptando una estrategia específica de trabajo en varias etapas. Esto ha implicado una optimización muy precisa del protocolo para determinar la reproducibilidad intralaboratorios del protocolo del ensayo y para asegurar la estabilidad de las condiciones experimentales de aplicación del ensayo Balb/3T3.<br/>Por consiguiente, después de la optimización del protocolo adoptado, el proyecto de tesis se desarrolló siguiendo una estrategia de cuatro etapas: a) determinación de la citotoxicidad a unas concentraciones de exposición fijadas (100 µM, 65 compuestos metálicos individuales). Esto permitió la selección de los compuestos metálicos que tendrían prioridad para las investigaciones subsiguientes; b) establecimiento de las relaciones dosis-efecto para 35 compuestos metálicos identificados como de primera prioridad en la etapa (a), para determinar los correspondientes valores de IC50 y un rango adecuado de concentraciones de exposición para ser utilizado en los pasos siguientes; c) determinación del potencial carcinogénico de los compuestos metálicos seleccionados a partir de la etapa (b); d) estudios sobre los mecanismos de transformación de las especies metálicas identificadas en la fase (c). En este contexto, una aproximación mecanística inicial fue la evaluación de la respuesta apoptótica inducida por los compuestos metálicos seleccionados en las células Balb/3T3. Este estudio sobre la apoptosis ha mostrado que se debería utilizar más de un ensayo para establecer inequívocamente la inducción de apoptosis por alguno de los compuestos metálicos en el sistema de ensayo escogido. Esto es debido a la complejidad del problema y a las dificultades para interpretar los datos experimentales. Por otra parte, los hallazgos sobre la respuesta apoptótica inducida por As(III), Cr(VI) y algunos compuestos de Pt sugieren la hipótesis de la existencia de una relación entre los procesos apoptótico, genotóxico y carcinogénico.<br/>Con respecto a los estudios mecanísticos y de metabolismo de los metales, los resultados obtenidos aplicando técnicas analíticas únicas y peculiares como el uso de radiotrazadores, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo, y resonancia magnética nuclear han hecho posible obtener interesantes datos metabólicos sobre la entrada y el reparto intracelular de los metales incorporados en las células. Éste es un aspecto generalmente olvidado en los estudios in vitro a pesar de ser un punto clave para la interpretación mecanística de la citotoxicidad y de la actividad transformante inducidas por los compuestos químicos.<br/>Además, se encontró un buen nivel de concordancia al comparar los resultados obtenidos de la aplicación del ensayo Balb/3T3 con los modelos in vitro seleccionados de roedores y humanos.<br/>En conclusión, la presente tesis representa una importante contribución para hacer que la línea celular Balb/3T3 sea un valioso modelo in vitro para investigar la correlación entre absorción, biotransformación, citotoxicidad y potencial carcinogénico de los compuestos metálicos. Se puede afirmar que el ensayo Balb/3T3 tiene el potencial para ser adecuado para un estudio futuro de validación.

In vitro morphological cell transformation tests encompass the multi-step process from neoplastic conversion to the established tumorigenic phenotype. In the present PhD thesis the in vitro Balb/3T3 assay, an immortalised mouse fibroblast cell line, was applied for assessing cytotoxicity and carcinogenic potential of selected metal compounds of environmental, occupational and biomedical interest by adopting a specific multi-stage work strategy. This has involved a very accurate protocol optimisation in order to assess intralaboratory reproducibility of the test protocol and to assure stability of the experimental conditions in which the Balb/3T3 assay was applied.<br/>Therefore, after optimisation of the adopted protocol the present PhD project was carried out following a "four steps approach": a) determination of cytotoxicity at a fixed concentration exposure (100 µM, 65 individual metal compounds). This allowed the selection of metal compounds to which priority is given for subsequent investigations; b) setting of dose-effect relationships for 35 metal compounds identified as first priority in step (a), in order to establish the corresponding IC50 values and a suitable exposure range of concentrations to be used in the subsequent steps; c) determination of carcinogenic potential of selected metal compounds from step (b); d) mechanistic studies on transforming metal species as identified in step (c). In this context, an initial mechanistic approach was the evaluation of the apoptotic response induced by selected metal compounds on the Balb/3T3 cells. This study on apoptosis has shown that more than one assay should be used in order to establish unequivocally the induction of apoptosis by a metal compound on the selected test system. This is due to the complexity of the problem and the difficulties to interpret the experimental data. Moreover, the findings on the apoptotic response induced by As(III), Cr(VI) and some Pt-compounds suggest the hypothesis of an existing relationship among apoptotic, genotoxic and carcinogenic processes.<br/>With regard to mechanistic studies and metal metabolism, the results obtained applying unique and peculiar analytical techniques like the use of radiotracers, Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance have made possible to get interesting metabolic data on uptake and intracellular repartition of metals incorporated into cells. This is an aspect generally neglected in in vitro studies although it is a key point for mechanistic interpretation of cytotoxicity and transforming activity induced by chemicals.<br/>In addition, a good level of concordance was achieved by comparing the results obtained from the application of the Balb/3T3 assay with selected in vitro rodent and human models.<br/>In conclusion, the present PhD project represents an important contribution to make the Balb/3T3 cell line as a valuable in vitro model to investigate correlation between uptake, biotransformation, cytotoxicity and carcinogenic potential of metal compounds. It is to state that the Balb/3T3 assay has the potential to be suitable for a future validation study.