Identificación y caracterización de la caja SOS de Ralstonia metallidurans y de Deinococcus radiodurans

Abstract

El sistema SOS de Escherichia coli ha sido durante mucho tiempo el modelo de referencia para su estudio en otras especies. Este sistema se encuentra en otros microorganismos incluyendo bacterias gramnegativas, grampositivas y otras. Recientemente se han encontrado diferencias entre las cajas SOS y los genes que integran el regulón SOS de E. coli con respecto a otras especies bacterianas.<br/>El propósito de este trabajo ha sido determinar y caracterizar las cajas SOS de dos especies bacterianas, Ralstonia metallidurans y Deinococcus radiodurans, pertenecientes a los grupos b-Proteobacterias y Deinococcus-Thermus, respectivamente.<br/>En primer lugar se realizó la clonación y secuenciación de los genes recA y lexA de R. metallidurans, el primero mediante hibridación con una sonda del gen recA de Agrobacterium tumefaciens y el segundo utilizando programas informáticos en los que se usó la secuencia del gen lexA de E. coli para identificar dicho gen en la secuencia parcial del genoma de R. metallidurans. Tras un análisis de sus regiones promotoras, se determinó que ambas contenían un motivo regulador, CTGT-N8-ACAG, idéntico al de E. coli.<br/>Se comprobó que esta caja reguladora era funcional tanto en R. metallidurans como en E. coli, evaluando su capacidad de inducir el gen recA frente a lesiones en el DNA. Adicionalmente se determinó que la caja SOS de este microorganismo se encontraba en varios genes que, en E. coli forman parte del regulón SOS, como recA, lexA y un hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. En cambio, no se identificó dicha caja en los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG, los cuales, en E. coli, también integran el regulón SOS. Mediante el análisis cuantitativo por RT-PCR on-line de los tránscritos se demostró que la expresión de todos estos genes era inducible al lesionar el DNA. Asimismo, mediante ensayos de movilidad electroforética, utilizando extractos proteicos de LexA de E. coli purificada y extractos crudos de R. metallidurans y R. metallidurans LexA(Def), se determinó que la proteína LexA era la responsable de la regulación de los genes recA, lexA y el hipotético gen de la familia impB/samB/mucB. Por el contrario, los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG no están bajo el control de la proteína LexA. Por lo tanto, si bien R. metallidurans posee una caja SOS idéntica a la de E. coli, solo algunos de los genes integrados en el regulón SOS de E. coli forman parte de este regulón en R. metallidurans. Además, el hecho de que los hipotéticos genes uvrA, ruvAB y dinG sean inducibles por lesiones en el DNA indica que deben estar sometidos a algún control independiente de LexA.<br/>Para determinar la caja SOS de D. radiodurans, se procedió a clonar el gen lexA obteniéndose su secuencia mediante programas informáticos que permiten localizar secuencias de un genoma con un determinado grado de similitud a otras secuencias conocidas. Una vez clonado dicho gen, se sobreexpresó la proteína LexA de este microorganismo y el extracto proteico obtenido se utilizó para realizar ensayos de movilidad electroforética frente al promotor del gen lexA de D. radiodurans, demostrándose que el gen lexA se autorregula. Seguidamente y mediante ensayos de movilidad electroforética se acotó al máximo la región promotora del gen lexA hasta identificar un posible motivo regulador. Mediante mutagénesis dirigida de las diferentes bases de dicho motivo se determinó que la proteína LexA de D. radiodurans reconoce específicamente el palíndromo CTTG-N8-CAAG como motivo de unión, siendo las bases señaladas en negrita las más importantes para la unión proteína-DNA. Finalmente se demostró que otros genes como recA o el hipotético lexA2 no tienen la misma caja SOS ni son regulados por LexA. Se concluye que la proteína LexA de D. radiodurans tiene un motivo regulador diferente a los anteriormente descritos para otros grupos de microorganismos y que debe haber un tipo de regulación diferente a los anteriormente descritos para los genes involucrados en procesos reparativos.

The SOS system in Escherichia coli has been the reference model for its study of other species. This system is present in other microorganisms including gramnegative, grampositive and other bacteria. Lately, some differences have been found between E. coli and other bacterial species in the SOS boxes and genes that compose the SOS regulon.<br/>The purpose of this work is to determine and characterize SOS boxes from two bacterial species, Ralstonia metallidurans and Deinococcus radiodurans, belonging to the b-Proteobacteria and Deinococci group, respectively.<br/>First, recA and lexA genes from R. metallidurans were cloned and sequenced, the former one by a hybridisation using an Agrobacterium tumefaciens recA gene's probe. The latter one was isolated with the help of informatics' programs using E. coli 's lexA gene' s sequence to find this gene in the partial sequenced genome from R. metallidurans. The promoter regions of both genes were analysed and it was discovered that they have the regulating motif, CTG-N8-ACAG, identical with the one of E. coli.<br/>The functionality of this regulating box in R. metallidurans and E. coli was demonstrated by determining the recA gene expression due to damage induction in both species. It was also approved that this SOS box controls the expression of some genes like recA, lexA, and the hypothetical gene of impB/samB/mucB family, which are included in E. coli SOS regulon. In contrast, this SOS box was not identified in other hypothetical genes like uvrA, ruvAB and dinG, which normally belong to E. coli 's SOS regulon. It was demonstrated that all of these genes' expression was induced by DNA damage, using a RT-PCR on-line technique to quantitatively analyse the transcripts. Furthermore, EMSAs (Electrophoretic Mobility Shift Assay), using purified E. coli 's LexA protein and R. metallidurans and R. metallidurans LexA(Def) crude protein extracts, confirmed that the LexA protein was responsible for the regulation of recA, lexA, and the hypothetical gene of impB/samB/mucB family genes. In contrast, hypothetical genes uvrA, ruvAB and dinG are not under the LexA protein control. Therefore, only some genes from E. coli's regulon conform R. metallidurans SOS regulon, even though R. metallidurans has a SOS box identical to E. coli's. Moreover, the fact that hypothetical genes uvrA, ruvAB and dinG are induced by DNA damage indicates that they most likely are under a LexA independent control.<br/>To determine the SOS box from D. radiodurans, the lexA gene was cloned. It's sequence was obtained using informatics programs that allow to locate regions from a genome similar to other known sequences. After cloning the lexA gene, the D. radiodurans 's LexA protein was overexpressed, and the protein extract obtained was used to perform EMSAs with the promoter region from the lexA gene of this microorganism. It was proved that this gene regulates itself. Using the same technique, serial deletions of the lexA promoter region were done, identifying a possible regulating motif. Each of the bases conforming the motif were directly mutagenized and it was determined that the D. radiodurans LexA protein recognizes specifically the palindrome CTTG-N8-CAAG as union motif; the bold printed bases are the most important ones for DNA-protein union. Finally, it was shown that other genes like recA or hypothetical gene lexA2 do not have the same box, and that they are not regulated by the LexA protein. In conclusion, D. radiodurans LexA protein has a regulating motif different from the ones formerly known for other bacterial groups. Most likely, it must be a regulation system which is different from those already defined for genes involved in reparation.