Tècniques de biologia molecular aplicades a l'estudi de sistemes estratificats

Abstract

En aquest treball s'han estudiat diferents sistemes estratificats, un de bentònic (tapissos microbians del delta de l'Ebre) i tres de planctònics (estanyols d'en Cisó i el Vilar i el llac Gran d'Estanya), mitjançant l'ús combinat de tècniques de microbiologia moleculars (RFLP, DGGE i FISH) i clàssiques (microscòpia òptica i anàlisi dels paràmetres fisicoquímics). L'aplicació de les tècniques moleculars ens ha permès demostrar que genèticament hi ha variacions, tant en fondària com al llarg del temps, en l'estructura i la dinàmica de les poblacions microbianes que habiten en aquests ecosistemes. Les tècniques clàssiques aplicades, en canvi, s'han emprat per a relacionar aquests canvis genètics amb les fluctuacions ambientals i biològiques.<br/>Inicialment, es va determinar la distribució en fondària i al llarg del temps de diferents paràmetres fisicoquímics que s'estableixen en els sistemes estratificats estudiats. A continuació, es van caracteritzar mitjançant microscòpia òptica el gruix, el color i les poblacions dominants presents en cadascuna de les laminacions dels tapissos microbians. De la mateixa forma, al llac Gran d'Estanya es van descriure les poblacions dominants presents en les diferents fondàries. L'anàlisi preliminar de tots els sistemes estratificats estudiats ens va permetre demostrar que, en general, les condicions i les poblacions dominants es mantenien força semblants a les descrites en treballs anteriors. Posteriorment, es dugué a terme l'anàlisi molecular amb tècniques de caracterització genètica (RFLP i DGGE) i d'hibridació in situ (FISH), basades en l'estudi dels 16S ADNr i 16S ARNr, respectivament.<br/>En cadascuna de les laminacions i fondàries dels diferents sistemes estratificats estudiats, els gens dels 16S ARNr foren amplificats per PCR amb encebadors universals per als dominis Bacteria i Archaea. El primer dels dominis es va trobar àmpliament distribuït en tots els sistemes estratificats i es va detectar al llarg de totes les laminacions i fondàries estudiades. En canvi, el domini Archaea presentava una distribució més heterogènia i es detectava en el sediment negre dels tapissos microbians i en les fondàries dels llacs on les concentracions de sulfur d'hidrogen eren més elevades. A l'estanyol del Vilar i al llac Gran d'Estanya, a més, es van detectar membres d'aquest darrer domini en algunes fondàries de la part oxigènica.<br/>Seguidament, els productes de la PCR van ser digerits amb enzims de restricció d'alta freqüència de tall (AluI, HinfI i RsaI) i es van analitzar els patrons dels 16S ADNr-RFLP bacterians obtinguts per electroforesi en cadascun dels sistemes estratificats.<br/>Aplicant els mètodes UPGMA i MDS, la similitud entre els patrons dels 16S ADNr-RFLP ens va permetre obtenir les corresponents matrius a partir de les quals es va poder concloure que les mostres presentaven una distribució estacional en tots els sistemes estudiats, exceptuant les del llac Gran d'Estanya. Malgrat aquest fet, les diferències estacionals quant al nombre de fragments de restricció només foren estadísticament significatives als tapissos microbians del delta de l'Ebre i a l'estanyol del Vilar. En tots els sistemes estratificats estudiats, les diferents submostres es van subagrupar, majoritàriament, en funció de dos paràmetres abiòtics, la llum i la presència d'oxigen.<br/>Una vegada visualitzats els patrons de restricció, s'observà que els obtinguts en el període de barreja al llac Gran d'Estanya mostraven una gran similitud amb els de la part més fonda del llac en el període d'estratificació. Per a corroborar aquesta observació, es va decidir aplicar al llac Gran d'Estanya un altra tècnica de caracterització genètica: la DGGE. Els patrons resultants dels 16S ADNr-DGGE, igual que els dels 16S ADNr-RFLP, van confirmar aquesta similitud. L'aplicació d'aquesta tècnica, a més a més, ens va permetre obtenir una visió general de la diversitat bacteriana per escissió i seqüenciació de les bandes dominants. Les seqüències obtingudes foren afiliades dintre dels quatre fílums del domini Bacteria: Cianobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Proteobacteria (classes a i b) i Chlorobi. L'anàlisi de les seqüències obtingudes demostrà que les diferències espacials eren degudes a variacions de les poblacions bacterianes dominants (Cianobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides i a-Proteobacteria) detectades en cadascuna de les fondàries del llac. En canvi, les diferències estacionals existents eren degudes, principalment, a l'aparició del grup b-Proteobacteria a l'hivern i a l'aparició de Chlorobi a l'estiu.<br/>Al llac Gran d'Estanya, a més de la informació qualitativa obtinguda amb les tècniques de caracterització genètica, per primera vegada s'ha estudiat quantitativament com es distribueixen en fondària i al llarg del temps les poblacions d'organismes actius mitjançant l'aplicació de la hibridació in situ. Tot i estar limitada per la presència de partícules de naturalesa inorgànica i per una elevada proporció d'organismes fototròfics autofluorescents, la informació obtinguda amb aquesta tècnica ens va permetre descriure canvis espaciotemporals de les poblacions bacterianes (sondes Eub338, Non338, Srb338, Dsv698, Dss658, Alf968, Bet42a i Gam42a) i d'Archaeas (sonda Arch915) analitzades. Els percentatges d'hibridació obtinguts pel domini Bacteria foren superiors en la part superficial del llac en el període d'estratificació, mentre que el domini Archaea fou més abundant en la part més fonda del llac del mateix període. Pertanyents al domini Bacteria, i detectats en ambdós períodes de l'any estudiats, la distribució dels percentatges d'hibridació dels bacteris sulfatoreductors i dels a-, b- i g-Proteobacteria varià en fondària. La comparació entre els percentatges d'hibridació obtinguts i els patrons dels 16S ADNr-RFLP determinà que, en alguns casos, tot i haver-hi diferències quantitatives, aquestes no es reflectien qualitativament.<br/>Finalment, per a esbrinar com podien quedar afectats els RFLP obtinguts en mostres naturals per dos factors que influencien l'eficiència de la PCR, la presència de mals aparellaments entre els encebadors i les seqüències diana d'aquests i el diferent nombre d'operons d'ADNr, es va desenvolupar una aproximació teoricopràctica. Amb aquest propòsit, es van seleccionar quatre soques bacterianes de les quals es coneixien ambdós paràmetres i es van analitzar els RFLP de diferents mescles. Els resultats obtinguts van demostrar que tots dos factors contribuïen significativament a l'hora d'obtenir els perfils genètics. D'aquesta forma, un nombre alt d'operons d'ADNr permetia una eficiència de detecció més gran, i un grau d'homologia més baix entre els encebadors i les seves seqüències diana implicava una disminució d'aquesta.

At this work, it has been studied different stratified ecosystems (microbial mats from Tarragona; Lakes Cisó and Vilar from Girona and Lake Estanya from Osca) by combining molecular (RFLP, DGGE and FISH) and classic (microscopic analysis and physicochemical parameter analyses) microbiological techniques. The application of molecular techniques has demonstrated that spatial and seasonal changes in the microbial composition are occurring in these ecosystems, whilst the second ones have been important to relate these genetic variations to biotic and abiotic fluctuations.<br/>Initially, spatio-temporal distribution of different physico-chemical parameters was determined in the ecosystems. Microbial mats were macroscopically (thickness and colour of each layer) and microscopically (dominant microbial populations) characterised. In Lake Estanya, microscopic analysis was also performed. The results obtained showed that conditions and dominant populations were very similar as previously described. Finally, it was performed the molecular analysis by applying genetic fingerprinting techniques (RFLP and DGGE) and fluorescence in situ hybridisation (FISH), based on the study of 16S rDNA and 16S rRNA, respectively.<br/>Genomic DNA extracted from standard strains, microbial mats and lake samples were approximately 23 kb size. Specific primers for Bacteria and Archaea domains were used to amplify by PCR the 16S rRNA genes from the whole microbial community present in each layer or depth in the ecosystems. Eubacteria domain was detected in all sampling times and depths or layers. Archaea primers yielded positive for all sampling times but mainly gave detectable product in the deeper part of the ecosystems (the black horizon in the microbial mat and the part of the lakes were sulphide concentration was high). The last domain was also detected in Lakes Vilar and Estanya in oxygenic depths.<br/>Then, bacterial PCR products that were obtained from the different ecosystems were digested with three separate restriction enzymes (AluI, HinfI, and RsaI) and then 16S rDNA-RFLP patterns were analysed by electrophoresis. Scoring similarities using the Jaccard coefficient performed RFLP patterns comparison. Applying the unweighted pair group method (UPGMA) and multidimensional scaling (MDS) analysis, afterwards, results showed a seasonal distribution with exception of Lake Estanya. In each seasonal cluster, subsamples also grouped together depending on the presence or absence of two abiotic parameters, light and/or oxygen.<br/>By PCR-RFLP analysis, restriction patterns from the entire water column in Lake Estanya were very similar to the patterns obtained in the deeper part of this lake in the stratified period. DGGE was used to corroborate the results obtained by RFLP fingerprinting. As happened by RFLP analysis, DGGE patterns showed the same distribution. Later amplification of 16S rRNA genes, the number of DGGE bands was compared and dominant bands were excised, sequenced, and identified. It was useful to obtain a preliminary overview of the dominant bacterial diversity in this ecosystem. By DGGE analysis and sequencing, sequences from dominant bands were affiliated into four major phyla of the Bacteria domain: Cyanobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Proteobacteria (a and b) and Chlorobium. In this lake, bacterial composition was changeable with depth, being differences displayed by the Cyanobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB) and a-Proteobacteria. Also, bacterial composition showed a seasonal variation, being these changes related to the b-Proteobacteria and Chlorobi.<br/>Using FISH we obtained quantitative information throughout the entire water column in Lake Estanya. However, this information was limited due to the high fraction of autofluorescent phototrophic organisms. Although the percentages of cells hybridising with specific probes (Bacteria domain: probes Eub338, Non338, Srb338, Dsv698, Dss658, Alf968, Bet42a and Gam42a; Archaea domain: probe Arch915) were low, intrasample and intersample variations were detected in this lake. The comparison of the hybridisation percentages in both periods showed that Bacteria and Archaea domains were at higher concentrations in the stratified period than in the other one, being their maximum concentration located in the upper part of the lake and in the deeper ones, respectively. Belong to Bacteria domain, sulphate-reducing bacteria and Proteobacteria (a, b and g) concentrations were different depending on the depth and period analysed.<br/>In this study, we have also developed a theoretic and practical approximation to elucidate how the presence of mismatches at the primers annealing regions and the different number of rDNA operons per cell can influence PCR and subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses from bacterial populations. We have performed RFLP analyses of 16S rRNA genes amplified by PCR from mixed bacterial cultures showing different primers identity and number of rDNA operons. Our results clearly corroborate that both factors, number of rDNA operons and primers identity, clearly influence the 16S rDNA-RFLP estimations. It has been demonstrated that higher number of operons leads to a higher efficiency of detection, but a lower degree of primer complementarity implies a decrease in such efficiency.