New approaches to estimate microbial diversity of alcoholic fermentation

Abstract

La fermentació alcohòlica la realitza una comunitat microbiana complexa, on els llevats vínics juguen un paper important. En els darrers anys, hi ha hagut un creixent interès per millorar complexitat del vi mitjançant fermentacions controlades quer utilitzaven no només S. cerevisiae sinó també soques seleccionades de llevats no-Saccharomyces. La investigació sobre la viabilitat dels llevats i les interaccions tenen un paper fonamental per entendre la diversitat de llevats en la fermentació mixta. En aquesta tesi, les tècniques independents de cultiu que es van aplicar per a l'anàlisi directa de mostres de vins inclouen la seqüenciació massiva, fluorescència per hibridació in situ (FISH) en combinació amb microscòpia i citometria de flux, RT-qPCR i EMA-DGGE. Aquestes tècniques independents de cultiu permeten una ràpida identificació i / o quantificació dels diferents llevats del vi. Aquestes tècniques han estat utilitzades en fermentacions espontànies a la regió del Priorat, i H. uvarum i Starm. bacillaris van ser les dues principals espècies de llevats no-Saccharomyces aïllades. H. uvarum o Starm. bacillaris perden gradualment la seva cultivabilitat quan els mostos es van inocular amb S. cerevisiae, però es podien quantificar cèl•lules de llevats en estat viable però no cultivable. La pèrdua de cultivabilitat dels no Saccharomyces va ser induïda principalment per alguns metabòlits secretats per S. cerevisiae, però els canvis en altres metabòlits principals també van influir. Aquesta interacció de llevat no Saccharomyces amb S. cerevisiae era específica d’espècie i soca.

La fermentación alcohólica es llevada a cabo por una comunidad microbiana compleja, donde las levaduras del vino juegan un papel importante. En los últimos años, ha habido un creciente interés para mejorar la complejidad del vino en fermentaciones controladas utilizando no sólo S. cerevisiae sino también algunas cepas seleccionadas de levaduras no-Saccharomyces. La investigación sobre la viabilidad de las levaduras y las interacciones tienen un papel fundamental para entender la diversidad de levaduras en fermentaciones mixtas. En esta tesis, se aplicaron técnicas independientes de cultivo para el análisis de muestras de vinos directa incluyendo la secuenciación masiva, fluorescencia por hibridación in situ (FISH) en combinación con microscopía y citometría de flujo, RT-qPCR y EMA-DGGE. Estas técnicas independientes de cultivo permiten una rápida identificación y / o cuantificación de las distintas levaduras del vino. Estas técnicas han sido utilizadas para el análisis de fermentaciones espontáneas en la región del Priorat, siendo las especies H. uvarum y Starm. bacillaris las dos principales especies de levaduras no-Saccharomyces. H. uvarum o Starm. bacillaris pierden gradualmente su cultivabilidad cuando los mostos se inocularon con S. cerevisiae, pero las levaduras se pudieron cuantificar en estado viable pero no cultivable. La pérdida de cultivabilidad de las especies no Saccharomyces fue inducida principalmente por algunos metabolitos secretados por S. cerevisiae, pero los cambios en otros metabolitos principales también influyen. Esta interacción entre levaduras no Saccharomyces con S. cerevisiae es especie y cepa dependiente.

Alcoholic fermentation is driven by complex microbial community, where wine yeasts play an important role. In recent years, there has been growing interest to enhance wine complexity by controlled fermentations using not only S. cerevisiae but also together with some selected non-Saccharomyces yeast strains. Research on yeast viability and interaction has a fundamental role to understand the diversity of yeast in mixed fermentations. In this thesis, culture-independent techniques were developed and applied for direct wine sample analysis including massive sequencing, fluorescence in situ hybridization (FISH) combined with microscopy and flow cytometry, RT-qPCR and EMA-DGGE. These culture-independent techniques enable fast identification and/or quantification of different wine yeasts. These techniques have been used during spontaneous fermentation in Priorat region, and H. uvarum and Starm. bacillaris where the two main non-Saccharomyces yeast species detected. H. uvarum or Starm. bacillaris gradually lost their culturability when musts were inoculated with S. cerevisiae, but quantifiable yeast cells existed in viable but non-culturable state. The culturability loss of non-Saccharomyces was mainly induced by some metabolites secreted from S. cerevisiae, but changes in other main metabolites also had some effect. This interaction of non-Saccharomyces yeast with S. cerevisiae showed the specificity of species and strains.