Control de la transposición e impacto de los elementos transponibles en genomas vegetales: análisis del retrotransposón Tnt1 de tabaco y del Mite Emigrant de Arabidopsis

Abstract

El trabajo presentado en esta tesis se centra en el estudio del impacto de los elementos transponibles sobre los genes y genomas vegetales y en los mecanismos de control de la transposición en estos genomas. Para ello se ha analizado, por un lado, la dinámica que ha seguido la familia Emigrant de MITEs dentro del genoma de Arabidopsis. Y, por otro lado, se analiza el control de la transcripción del retrotransposón Tnt1 de tabaco.<br/>1. ESTUDIO DEL IMPACTO DE LOS ELEMENTOS TRANSPONIBLES SOBRE LOS GENOMAS VEGETALES: Análisis de la familia Emigrant de MITEs de Arabidopsis thaliana.<br/>Los MITEs son pequeños transposones de DNA sin capacidad codificante, presentes en un elevado número de copias en la mayoría de los genomas. Se postula que son movilizados por elementos autónomos emparentados, presentes en los mismos genomas. El primer grupo de MITEs descrito en Arabidopsis fue la familia Emigrant (Casacuberta et al., 1998).<br/>El objeto de nuestro estudio es conocer la dinámica de estos elementos y su efecto sobre la evolución de los genes y genoma de Arabidopsis.<br/>Gracias a la disponibilidad de la secuencia genómica de Arabidopsis se ha diseñado un programa informático para identificar todas las copias de elementos Emigrant contenidas en el genoma de Arabidopsis. Con tal de encontrar el máximo número de elementos Emigrant, se fundamentó la búsqueda en las repeticiones terminales (TIRs) conservadas que definen esta familia de MITEs. De esta forma se pueden encontrar subfamilias representadas por un bajo número de copias o aquellas copias antiguas y, por tanto, más divergentes, de transposones Emigrant, presentes en el genoma de Arabidopsis. También se han desarrollado otras herramientas informáticas que han permitido realizar análisis filogenéticos y evolutivos de estos elementos. A su vez, mediante técnicas moleculares se ha estudiado el polimorfismo de estos MITEs existente entre diferentes ecotipos de Arabidopsis.<br/>Mediante estos análisis se han identificado 151 copias Emigrant distribuidas por todo el genoma de Arabidopsis. La mayoría de éstas se pueden agrupar en tres familias, cada una de las cuales puede ser subdividida, a su vez, en subfamilias de variabilidad diferente. El análisis de estas subfamilias ha revelado que mientras que las copias más recientes se localizan lejos de secuencias génicas, aquellos elementos más antiguos aparecen frecuentemente asociados a genes. Esto sugiere que los elementos Emigrant han podido jugar un papel importante en la evolución de los genes de Arabidopsis. Los resultados obtenidos se han publicado en la revista de carácter científico Molecular Biology and Evolution (Santiago et al., 2002). Además la existencia de polimorfismos de inserción de estos transposones entre diferentes ecotipos de Arabidopsis indica la existencia de una actividad reciente de movilización de estos elementos.<br/>2. ESTUDIO DEL CONTROL DE LA TRANSPOSICIÓN: Análisis del control de la expresión del retrotransposón Tnt1 de tabaco.<br/>Tnt1 fue el primer retrotransposón activo de plantas descrito (Grandbastien et al., 1989). Está presente en cientos de copias en el genoma de tabaco y se expresa en ciertas condiciones de estrés (Casacuberta y Grandbastien, 1993; Mhiri et al., 1997).<br/>Por otra parte el silenciamiento génico parece ser el principal mecanismo por el que los diferentes organismos controlan la proliferación de los elementos transponibles y secuencias extrañas dentro de sus genomas (Vaucheret y Fagard, 2001; Hammond et al., 2001; Rudenko et al., 2003).<br/>En el trabajo presentado en esta memoria se analiza el control de la expresión del retrotransposón Tnt1 a nivel de la terminación de la transcripción y poliadenilación del mRNA y a nivel de la conformación de la cromatina, mediante el estudio de cambios en el silenciamiento de Tnt1 en condiciones de estrés. Se analiza la existencia y variación de intermediarios del silenciamiento, como siRNAs y modificaciones de la cromatina.<br/>En este trabajo se han diseñado diferentes estrategias para inducir el silenciamiento transcripcional de transgenes cuya expresión está promovida por el promotor 35S del CaMV. Los resultados obtenidos indican que en condiciones de estrés se relaja el silenciamiento del retrotransposón Tnt1 sin que se vea comprometido el silenciamiento de otros transgenes estudiados. Por esta razón se decidió caracterizar molecularmente el silenciamiento de Tnt1.<br/>Se han identificado siRNAs que pueden estar mediando la represión de Tnt1 en hoja de tabaco, cuando este elemento no se transcribe y sus secuencias promotoras están asociadas a cromatina inactiva. <br/>Por otra parte, con tal de conocer de qué manera Tnt1 supera su silenciamiento y se expresa en situaciones de estrés, se ha analizado la influencia de la región U3 de las LTRs de este retrotransposón (donde se localizan los elementos promotores de su transcripción) sobre este proceso. Los resultados obtenidos sugieren que la región U3 no es suficiente para superar el silenciamiento de Tnt1 y que quizás otras secuencias de la LTR o factores estructurales son las que permiten la expresión del retrotransposón.

The work presented in this doctorate thesis focuses on the analysis of plant transposable elements. Here is described the study of the impact these sequences have had on plant genes and genomes and, on the other hand, on the control of the proliferation of the transposable elements within genomes. In particular, I have analysed de dynamics of the Emigrant family of MITEs within the Arabidopsis genome and the transcriptional control of the tobacco Tnt1 retrotransposon.<br/>1. STUDY OF THE IMPACT OF TRANSPOSABLE ELEMENTS ON PLANT GENOMES: Genome-wide analysis of the Emigrant family of MITEs from Arabidopsis thaliana.<br/>MITEs are short DNA transposable elements lacking any coding capacity. They are found in a high copy number in most of the analysed genomes. They are supposed to be mobilized by other longer related autonomous elements present in the same genomes. The first MITE described in the plant Arabidopsis thaliana was the Emigrant family (Casacuberta et al., 1998).<br/>The object of the study here described is to understand the dynamics of these elements and their effect on the Arabidopsis genes and genome evolution.<br/>In order to detect divergent ancient copies and low copy number subfamilies with a different internal sequence we have developed a computer program to look for Emigrant elements based solely on the terminal inverted-repeat (TIR) sequence. The development of other computer applications has allowed us to do phylogenetic and divergence analysis of all the copies found. At the same time, using molecular biology methods we have analysed different Arabidopsis ecotypes in order to know if there are Emigrant insertion polymorphisms among them.<br/>We have detected 151 Emigrant elements distributed along the Arabidopsis genome. Most of these copies are grouped in three families, each of these containing different subfamilies of different sequence homogeneity. The analysis of these subfamilies has revealed us that the most recent elements are inserted out from genic sequences, contrary to the oldest ones that are preferentially associated to genes. These results suggest that the Emigrant MITEs have probably played an important role on Arabidopsis gene evolution. In addition, the existing polymorphism resulting from the presence or absence of different Emigrant copies detected between the Arabidopsis ecotypes imply a recent mobilization of these elements.<br/>2. STUDY OF THE CONTROL OF TRANSPOSITION: Analysis of the tobacco Tnt1 retrotransposon transcriptional control.<br/>Tnt1 is the first active plant retrotransposon described (Grandbastien et al., 1989). It is found in hundred copies in the tobacco genome and it is expressed under some stress conditions (Casacuberta y Grandbastien, 1993; Mhiri et al., 1997).<br/>On the other hand, gene silencing seems to be the major mechanism developed by the different organisms to control de proliferation of transposable elements and foreign sequences within their genomes (Vaucheret y Fagard, 2001; Hammond et al., 2001; Rudenko et al., 2003).<br/>In this section, I present the analysis of the control of Tnt1 retrotransposon expression at two different levels. I have analyzed the termination and polyadenylation of the Tnt1 mRNAs and, on the other hand, I have studied the epigenetic control of Tnt1 expression by gene silencing mechanisms and changes in the chromatin associated to Tnt1 sequences. I have looked for and analyzed silencing intermediates, like siRNAs and chromatin modifications.<br/>Different strategies to induce the transcriptional gene silencing of the CaMV 35S promoter are also here described. The results obtained from these approaches suggest that the gene silencing operating on Tnt1 retrotransposon disappears specifically in stress conditions when other silenced loci seem to be kept repressed.<br/>On the other hand, in order to understand how Tnt1 is transcriptionally re-activated under stress conditions we have analyzed the role of the U3 region of the Tnt1 LTRs (which contain the transcriptional promoter elements) in the change of its silencing status. The results here presented suggest that the U3 region not only is not able to overcome silencing but also seem to be target of this process when the endogenous copies of Tnt1 are expressed and that other different regions of the Tnt1 sequence as well as structural factors may take part in the retrotransposon re-activation.