Caracterització del genoma i anàlisi del regulador gènic del bacteriòfag SE1 de Salmonella enterica

Abstract

Estudis previs duts a terme en el nostre laboratori han caracteritzat estructuralment i fenotípicament el bacteriòfag SE1. Aquest bacteriòfag presenta una elevada freqüència de transducció, capaç d'infectar S. enterica, serovar Enteritidis i serovar Typhimurium. Seguint aquesta línea d'investigació, el present treball s'ha plantejat ampliar la descripció genètica d'aquest bacteriòfag i caracteritzar les diferents funcions del fag SE1 en estat de lisogènia, tals com la conversió lisogènica, la integració i el seu regulador o interruptor genètic .<br/>La seqüenciació del genoma del bacteriòfag SE1, a partir d'una genoteca fàgica o per walking directament sobre el genoma, ha permès determinar que té una llargària de 41.941 pb, que es concreta en 67 orf. La comparació amb la base de dades GenBank ha revelat que aquest fag, com d'altres fags lambdoides, és un mosaic genètic resultat de recombinacions i transferències horitzontals amb d'altres bacteriòfags. <br/>La seqüència obtinguda va permetre mostrar que la deficiència en l'extrem carboxi terminal periplasmàtic de la proteïna codificada per un dels gens de conversió lisogènica (GtrC) podria ser la causa per la qual el bacteriòfag P22 podria infectar una cèl·lula lisògena per al bacteriòfag SE1.<br/>A més, en el present treball s'han determinat les seqüències dels operadors de la regió reguladora que interaccionen amb la proteïna cI de l'interruptor o regulador genètic. A través d'assaigs de retard electroforètic (EMSA) i de footprinting s'ha definit la seqüència consens dels motius d'unió dels operadors a la proteïna cI: AtAN3tTN3TATT.<br/>D'altra banda, l'anàlisi de la composició de la unitat transcripcional del gen cI per RT-PCR va permetre determinar que el gen orf23 en formava part. La proteïna Orf23 seria un potencial regulador membre de la superfamília de les ATPases involucrades en la partició genòmica. Mutants defectius en aquest gen presenten un increment de la inducció del cicle lític en presència de mitomicina C, la qual cosa indica que aquesta proteïna podria ser un modulador de la proteïna cI o que podria haver-hi una interacció entre la proteïna Orf23 i la proteïna cI. Aquesta és la primera vegada que es caracteritza una proteïna d'aquesta família d'ATPases en un bacteriòfag que s'integra en el genoma del seu hoste.

Carried out previous studies in our laboratory have characterized structurally and phenotipically the bacteriophage SE1. This bacteriophage presents a high frequency of transduction; it is able to infect S. enterica, to serovar Enteritidis and to serovar Typhimurium. Continuing this line of investigation, in the present work we have considered to extend the genetic description of this bacteriophage and to characterize different functions from phage SE1 in lysogen state, such as the lysogenic conversion, integration and its regulator or genetic switch. The sequencing of the bacteriophage SE1 genome, from its genotec or by walking directly on the genome, has allowed us to determine that it has a 41,041 pb of length, that takes shape in 67 orfs. The comparison with the data base of the GenBank has revealed that this phage, like other lambdoids phages, is a genetic mosaic result of recombination and horizontal transferences with other bacteriophages. The obtained sequence allowed us to show that the deficiency in the periplasmatic carboxi terminal end of the protein (GtrC) codified by one of the genes of lysogenic conversion could be the cause by which the bacteriophage P22 would be able to infect a lysogen cell by bacteriophage SE1. In addition, in the present work, the sequences of operators of regulating region have been determined, which interact with protein cI of the switch or genetic regulator. Through tests of electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and footprinting consensus sequence for union of operators to protein cI has been defined: AtAN3tTN3TATT. On the other hand, analysis of the composition of gene cI transcriptional unit by RT-PCR allowed us to determine that the gene orf23 comprised of the same one. The Orf23 protein is a regulating potential member of the superfamily of the ATPases involved in the genomic partition. Defective mutants in this gene present an increase of the induction of the lytic cycle in presence of mitomicina C, this indicates that this protein could be a modulator of the protein cI or that could have an interaction between the Orf23 protein and protein cI. This is the first time that a protein of this family of ATPases is characterized in a bacteriophage which integrates in the genome of its host cell.

Estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio han caracterizado estructuralmente y fenotípicamente el bacteriófago SE1. Este bacteriófago presenta una elevada frecuencia de transducción, capaz de infectar S. enterica, serovar Enteritidis y serovar Typhimurium. Continuando esta línea de investigación, en el presente trabajo se ha planteado ampliar la descripción genética de este bacteriófago y caracterizar las diferentes funciones del fago SE1 en estado de lisogenia, tales como la conversión lisogénica, la integración y su regulador o interruptor genético.<br/>La secuenciación del genoma del bacteriófago SE1, a partir de su genoteca o por walking directamente sobre el genoma, ha permitido determinar que tiene una longitud de 41.041 pb, que se concreta en 67 orfs. La comparación con la base de datos del GenBank ha revelado que dicho fago, como otros fagos lambdoides, es un mosaico genético resultado de recombinaciones y transferencias horizontales con otros bacteriófagos.<br/>La secuencia obtenida permitió mostrar que la deficiencia en el extremo carboxi Terminal periplasmático de la proteína codificada por uno de los genes de conversión lisogénica (GtrC) podría ser la causa por la cual el bacteriófago P22 podria infectar una célula lisógena por el bacteriófago SE1.<br/>Además, en el presente trabajo se han determinado las secuencias de los operadores de la región reguladora que interaccionan con la proteína cI del interruptor o regulador genético. A través de ensayos de retardo electroforético (EMSA) y de footprinting se ha definido la secuencia consenso de los motivos de unión de los operadores a la proteína cI: AtAN3tTN3TATT.<br/>Por otro lado, el análisis de la composición de la unidad transcripcional del gen cI por RT-PCR permitió determinar que el gen orf23 formaba parte de la misma. La proteína Orf23 seria un potencial regulador miembro de la superfamilia de las ATPasas involucradas en la partición genómica. Mutantes defectivos en este gen presentan un aumento de la inducción del ciclo lítico en presencia de mitomicina C, esto indica que esta proteína podría ser un modulador de la proteína cI o que podría haber una interacción entre la proteína Orf23 y la proteína cI. Esta es la primera vez que se caracteriza una proteína de esta familia de ATPasas en un bacteriófago que se integra en el genoma de su hospedador.