Estudio de la implicación de los genes Rv0576-Rv0577 en la tinción con rojo neutro y la virulencia de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

El conocimiento de los factores de virulencia de Mycobacterium tuberculosis es primordial para el desarrollo de nuevos fármacos y vacunas, esenciales para combatir esta enfermedad infecciosa que causa anualmente 1,7 millones de muertes. Una característica distintiva de las cepas virulentas de M. tuberculosis es la capacidad de fijar el colorante rojo neutro en su forma ácida. En trabajos anteriores se refutó la relación, ampliamente aceptada hasta el momento, entre este comportamiento y el sulfolípido (un componente de la envuelta celular); y se determinó que el gen Rv0577, cotranscrito con el posible regulador transcripcional Rv0576, confería a M. smegmatis (una micobacteria saprófita) el fenotipo rojo neutro positivo de las cepas virulentas de M. tuberculosis.<br/>En el presente trabajo, mediante fusiones transcripcionales y el análisis con microchips, se ha demostrado que el gen Rv0576 es, efectivamente, un regulador transcripcional que reprime la expresión del operón Rv0576-Rv0577. Sin embargo, el estudio de cepas mutantes y complementadas en estos genes ha mostrado que ninguno de estos dos genes es necesario para la tinción con rojo neutro de M. tuberculosis, ni para la virulencia en el modelo de infección murino.<br/>Asimismo se ha comprobado que M. tuberculosis, in vitro, forma poblaciones celulares heterogéneas para el carácter rojo neutro y para la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol, unos lípidos de la envuelta celular relacionados con la virulencia del bacilo. Los mutantes espontáneos rojo neutro negativos revierten, con cierta frecuencia, al fenotipo salvaje; mientras que no se ha detectado reversión en los mutantes en la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol, que se acumulan con las sucesivas resiembras de M. tuberculosis, hasta resultar en la población mayoritaria. Estas observaciones, y la relación de la tinción con rojo neutro y de los dimicocerosatos de ftiocerol con la virulencia de M. tuberculosis, ponen de manifiesto la necesidad de comprobar estos fenotipos antes de realizar el análisis de la virulencia de una determinada cepa o mutante de M. tuberculosis.

The identification of Mycobacterium tuberculosis virulence factors is necessary to develop new drugs and vaccines, urgently needed to fight an infectious disease that causes 1.7 million deaths annually. A unique feature of the virulent strains of M. tuberculosis is their ability to fix the neutral red stain in its acid form. Although sulfolipid (a component of the cell envelope) was first recognized as the molecule responsible for the neutral red uptake, recent studies have refuted this relationship, and have established that the Rv0577 gene, which constitutes a single operon together with the putative transcriptional regulator Rv0576, provides M. smegmatis (a saprophytic mycobacteria) with the neutral red positive phenotype characteristic of M. tuberculosis virulent strains.<br/>In the present work, by means of transcriptional fusions and microarray analysis, we have proved that the Rv0576 gene indeed behaves as a transcriptional regulator that represses the expression of the Rv0576-Rv0577 operon. However, studies of mutant and complemented strains in these genes have shown that none of them is necessary either for the neutral red reaction of M. tuberculosis or for virulence in the murine infection-model.<br/>We have also proved that, in vitro, M. tuberculosis forms heterogeneous cell populations regarding the neutral red character and the synthesis of phthiocerol dimycocerosates, a cell-wall lipid related to the virulence of the bacillus. Reversion of the spontaneous neutral red mutants to the wild-type phenotype occurs at certain frequency, whereas reversion of the mutants in the synthesis of phthiocerol dimycocerosates has not been detected and they accumulate with successive cultures of M. tuberculosis, becoming the bulk of the population. As both the neutral red character and phthiocerol dimycocerosates are related to M. tuberculosis virulence, it would be prudent to check these phenotypes before analyzing the virulence of a certain strain or mutant of M. tuberculosis.