Caracterización de cepas y de plásmidos de Enterobacteriaceae portadores de ß-lactamasas de espectro extendido

Abstract

La resistencia bacteriana a los antimicrobianos, y en particular la producción de ß- lactamasas plasmídicas de espectro extendido (BLEE), es un grave problema descrito principalmente en cepas de origen clínico. Sin embargo, no existen muchos datos sobre la prevalencia y la capacidad de difusión de estas resistencias en otros ambientes. Por ello, los objetivos de esta Tesis se enmarcan en un amplio proyecto coordinado cuya finalidad ha sido el estudio de la prevalencia de BLEE, cefamicinasas y carbapenemasas en diversos ambientes, determinar la transmisibilidad de estas resistencias y, finalmente, identificar y caracterizar los plásmidos que las codifican. <br/>En este trabajo, en primer lugar se han estudiado 107 cepas procedentes de granjas de aves, de cerdos y de conejos, siendo todas ellas Escherichia coli, a excepción de una cepa de Enterobacter cloacae. No se ha encontrado ninguna cepa portadora de la resistencia a carbapenémicos, aunque si se describe la presencia de la ß-lactamasa plasmídica CMY-2 y de una gran diversidad de enzimas BLEE. Además, el 93% de las cepas fueron resistentes a dos o más de los antibióticos no ß-lactámicos probados. En las granjas de aves, la enzima CTX-M-14 y la cefamicinasa CMY-2 han sido las más frecuentes. Por el contrario, en las de cerdos la enzima CTX-M-1 ha sido la más prevalente. Se describe, por primera vez, la presencia de las enzimas TEM-52 y SHV-2 en las granjas de aves, la enzima SHV-5 en las de cerdos y la enzima CMY-2 en las de conejos. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las granjas de animales actúan como un reservorio de genes de BLEE y CMY-2. Asimismo, se ha determinado el grupo filogenético y el estatus ExPEC de las 106 cepas de E. coli aisladas de granjas de animales. La mayoría de las cepas han sido definidas como comensales al pertenecer a los filogrupos A y B1. Aunque una proporción significativa de cepas procedentes de granjas de aves pertenece a los filogrupos B2 y D, ambos vinculados a cepas patógenas. Por el contrario, en granjas de cerdos las cepas mayoritarias han sido las pertenecientes al filogrupo A. Del total de las cepas estudiadas, sólo 10 se han caracterizado como ExPEC, presentando éstas una media de nueve factores implicados en la virulencia. La gran mayoría de estas cepas proceden de granjas de aves, pertenecen al filogrupo D y codifican la enzima CMY-2. Además, cabe enfatizar el hecho no descrito hasta el <br/>momento, de que dos de las tres cepas aisladas de conejos han sido caracterizadas como <br/>ExPEC.<br/>En segundo lugar, se han seleccionado 111 cepas de enterobacterias, aisladas de granjas de animales, de alimentos, de muestras clínicas, de muestras fecales de portadores sanos, de brotes alimentarios y de aguas residuales y se ha estudiado la transmisibilidad de las BLEE y CMY-2. Más del 70% de dichas cepas transfirieron por conjugación estas resistencias. Además, un 29,2% de las cepas transconjugantes obtenidas presentaron resistencias a los antibióticos no ß-lactámicos. Por otra parte, las enzimas CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, familia SHV y CMY-2 fueron las que se transfirieron con una mayor frecuencia.<br/>Finalmente, se han caracterizado los plásmidos conjugativos, presentes en las 111 cepas que codificaban BLEE y CMY-2. Para ello, se ha determinado su peso molecular mediante electroforesis en campo pulsante, y se ha identificado el grupo de incompatibilidad al cual pertenecen. Esta identificación se ha llevado a cabo mediante hibridación con sondas frías por dot blot y Southern blot y por PCR y secuenciación. Los resultados obtenidos indican que hay una clara concordancia entre los plásmidos que, aún procediendo de diversos ambientes, presentan características muy similares como son la enzima que codifican, el grupo de incompatibilidad al que pertenecen y, en ciertos casos su tamaño. Así, la extensa mayoría de los plásmidos que codifican de la enzima CTX-M-14a, pertenece al grupo IncK. De igual forma, las enzimas del grupo CTX-M-1 se han localizado en plásmidos IncN. La enzima CMY-2 se ha transferido en plásmidos de alto peso molecular portadores de dos replicones, IncQ e IncA/C2. En cambio, la enzima CTX-M-9 se ha vehiculizado en plásmidos con grupos Inc muy variados, aunque cabe destacar el hecho de que tres de ellos pertenecen al IncHI2.

Bacterial resistance mediated by extended spectrum ß-lactamases (ESBL) is a great concern that has been described mainly in clinical strains. However, there is no so much data about the prevalence and capacity of diffusion of this type of resistances in other environments.<br/>Therefore, the objectives of the present Thesis have been to study the prevalence of ESBL, plasmidic class C ß-lactamase and carbapenemases in diverse environments, to determine the transmissibility of these resistances and, finally, to identify and characterize the plasmid that codify these resistances. <br/>First of all, in this work it have been studied 107 strains from poultry, pig and rabbit farms, being all of them Escherichia coli but one Enterobacter cloacae strain. None strains have carried resistance to carbapenemics, although it have been described the CMY-2 enzyme and a great variety of ESBL. Moreover, the 93% of the strains showed resistance to two o more non-ß-lactam antibiotics tested. In poultry farms, the enzymes CTX-M-14 and CMY-2 were the most frequent. By the contrary, in pig farms, the enzyme CTX-M-1 was the most prevalent. To the best of our knowledge, this is the first time that it is described the enzymes TEM-52 and SHV-2 in poultry farms, the enzyme SHV-5 in pig farms and the CMY-2 in rabbit farms. The results obtained here; show that animal farms act as a reservoir or ESBL and CMY-2 genes. Moreover, it have been determined the phylogenetic group and the ExPEC status of the 106 E. coli strains. The majority of the strains have been identified like commensal even though they belong to the groups A and B1. However, a high percentage of the strains coming from poultry farms belong to the phylogenetic groups B2 and D, being both groups associated to pathogenic strains. By the contrary, in pig farms the majority of the strains derive from the phylogenetic group A. Only, ten strains have been characterized as ExPEC, carrying these strains nine virulence markers of average. The majority of the ExPEC strains derived form poultry farms been associated to the phylogenetic group D and codifying the enzyme CMY-2. It is important to denote that two of the three strains isolated from rabbit farms are ExPEC.<br/>Secondly, it has been selected 111 strains from Enterobacteriaceae, isolated from several environments: animal farms, food, food-borne outbreaks, community, clinical patients and human sewage and it has been studied the transmissibility of the ESBL and CMY-2. More than 70% of these strains transferred by conjugation these resistances. Moreover, a 29.2% of the transconjugant strains showed resistance to non-ß-lactam antibiotics. The enzymes CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, the family SHV and CMY-2 were the most transferable.<br/>Finally, it have been characterized the conjugative plasmids carrying ESBL of CMY-2 of the 111 strains. To do that, it have been determined the molecular weight of the plasmids by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and their incompatibility group have been identified. The identification of the incompatibility group have been done by dot blot, Southern blot, PCR and sequencing. The results obtained show that there are a high degree of correlation among the Inc group to which the plasmids belong, the enzyme that they encode, and their size. So, the majority of plasmids that codify the enzyme CTX-M-14a belong to IncK group. Similarly, the enzymes of the group CTX- M-1 have been located in IncN plasmids. The plasmidic class C ß-lactamase, CMY-2, have been transferred in plasmids with high molecular weigh carrying the replicons IncQ and IncA/C2. By contrast, conjugative plasmids codifying of the enzyme CTX-M- 9 belong to different Inc groups, although three of them pertain to IncHI2.