Caracterización de los sistemas de captación de zinc y de hierro en Streptococcus suis: Potencial antigénico y protector

Abstract

Streptococcus suis es un importante patógeno que causa grandes pérdidas económicas en la industria porcina a nivel mundial, siendo también un importante agente zoonótico. Aunque son varias las aproximaciones que se han desarrollado mediante vacunas vivas o recombinantes para prevenir las enfermedades provocadas por S. suis, los esfuerzos para controlar su infección se ven dificultados por la falta de herramientas efectivas contra este patógeno.<br/>Diferentes tipos de transportadores implicados en la captación de cationes divalentes y asociados a la pared celular, entre ellos los transportadores ABC, se relacionan con la virulencia bacteriana y presentan propiedades inmunogénicas contra las especies bacterianas de las que derivan. Atendiendo a todas estas características, se han desarrollado estrategias para producir vacunas contra las bacterias patógenas basadas en la sobreexpresión en la superficie celular bacteriana de transportadores de cationes divalentes inducidos mediante agentes quelantes o a través de la construcción de cepas deficientes en los represores de la transcripción de estos transportadores. En este contexto, el objetivo del presente trabajo ha sido estudiar los mecanismos de captación de cationes divalentes de S. suis, así como su papel en la virulencia y su posible uso para el desarrollo de herramientas eficaces contra este patógeno. <br/>Para abordar el objetivo propuesto, se identificaron in silico diversos transportadores de S. suis implicados en la captación de zinc y hierro y también sus posibles reguladores (AdcR y Fur, respectivamente). Además, se clonó el gen adcR de S. suis, que codifica un posible regulador de los transportadores implicados en la captación de Zn2+ y/o Mn2+ en Streptococcus spp., se purificó la proteína AdcR y mediante ensayos con DNasaI (footprinting) y de movilidad electroforética se demostró, por primera vez, que dicha proteína reconoce y se une específicamente a la secuencia TTAACNRGTTAA. Asimismo, también se ha demostrado que in vitro se requiere Zn2+ o Mn2+ para establecer dicha unión y que la proteína AdcR controla la expresión de los genes que codifican las proteínas SsuiDRAFT 0103 y SsuiDRAFT 1237, componentes de transportadores ABC implicados en la captación de zinc y/o manganeso. <br/>Por otra parte, se clonó el gen fur de S. suis, que codifica el posible regulador de los transportadores implicados en la captación de Fe2+, y se sobreexpresó su producto en Escherichia coli. Ensayos de movilidad electroforética con extracto crudo de esta cepa de E. coli mostraron que la proteína Fur de S. suis controla la expresión de los genes feoAB, implicados en la captación de hierro.<br/>Seguidamente, se obtuvieron mutantes mediante la deleción de los genes adcR y fur en una cepa virulenta de S. suis con el objetivo de caracterizar ambos regulones. Varios transportadores implicados en la captación de cationes aparecieron desreprimidos en las cepas mutantes cuando la expresión génica fue comparada con la de la cepa salvaje a través de ensayos de RT-PCR a tiempo real. En concordancia con ello, los ensayos de movilidad electroforética mostraron que estos reguladores se unen específicamente al promotor de dichos genes. Asimismo, la ausencia de los genes adcR y/o fur en un estreptococo patógeno mostró, por primera vez, una importante atenuación de su virulencia en el modelo animal de ratón.<br/>Finalmente, se abordaron estudios de inmunogenicidad y protección. Para ello, se purificaron tres proteínas periplásmicas de S. suis implicadas en la captación de cationes divalentes (SsuiDRAFT 0103, SsuiDRAFT 0174 y SsuiDRAFT 1237), resultando ser todas ellas inmunogénicas, aunque sólo SsuiDRAFT 0103 confiere una protección significativa contra S. suis en el modelo animal de ratón. Además, las proteínas Ssu0309 y Ssu1103 asociadas a la pared celular, que están sobreexpresadas en el mutante adcR, fueron identificadas mediante espectrometría de masas como factores de virulencia pertenecientes a la familia de proteínas Pht (Pneumococcal histidine triad). Asimismo, se estudiaron las propiedades protectoras de las cepas mutantes demostrándose que aunque enteras no confieren protección contra S. suis en el modelo animal de ratón, las proteínas asociadas a la pared celular del doble mutante adcR fur sí que inducen una protección significativa ante una infección con la cepa virulenta de S. suis 89/1591 en dicho modelo.

Streptococcus suis is an important pathogen that causes significant economical losses in the swine industry worldwide and it is also an important zoonotic agent. Although several approaches to develop either live or recombinant vaccines to prevent S. suis-mediated disease have been tested, efforts to control the infection are hampered by the lack of effective weapons against this pathogen.<br/>Different cell-wall-associated transporters involved in divalent-cation uptake, including ABC transporters, have been shown to be involved in bacterial virulence and have immunogenic properties against the bacterial species from which they are derived. Accordingly, several strategies have been developed to produce vaccines against this pathogenic bacterium. One of them involves overexpression on the bacterial cell surface of divalent-cation-uptake transporters induced by chelator agents or by the construction of deficient strains in the cation-uptake repressors. In this context, the aim of this work has been to study the S. suis-cation-uptake mechanisms and their role in virulence as well as their putative use as a tool to achieve broad protection against this pathogen. <br/>To achieve this purpose, several transporters involved in zinc and iron uptake and their putative regulators (AdcR and Fur, respectively) have been identified in silico. Furthermore, the S. suis adcR gene, which encodes a predicted regulator of Zn2+ and/or Mn2+ uptake in streptococci, was cloned and its protein product was purified. Footprinting and electrophoretic mobility shift assays with purified S. suis AdcR protein showed, for the first time, that the AdcR-DNA binding sequence corresponds to the TTAACNRGTTAA motif. In addition, the requirement for either Zn2+ or Mn2+ to establish in vitro binding of AdcR to its target sequence and the ability of AdcR to control the genes codifying the ABC-transporter components SsuiDRAFT 0103 and SsuiDRAFT 1237, involved in zinc and/or manganese uptake, were demonstrated.<br/>Besides, the S. suis fur gene, which encodes a predicted regulator of Fe2+ uptake, was cloned and its protein product was overexpressed in Escherichia coli. Electrophoretic mobility shift assays with crude extract of this E. coli strain showed that S. suis Fur protein controls the feoAB genes, involved in ferric uptake. <br/>In addition, both adcR and fur genes were deleted in a virulent S. suis strain in order to charecterize these regulons. Several cation-uptake transporters appeared desrepressed in the knockout strains when gene expression was compared with wild-type strain through real-time RT-PCR analyses. Accordingly, EMSA results showed that these regulators specifically bind to the promoter of these genes. Moreover, the absence of adcR and/or fur genes in pathogenic streptococci showed, for the first time, an important attenuation of its virulence in mice.<br/>Finally, immunogenic and protective analysis were carried out with the products of three genes encoding putative divalent-cation-binding lipoproteins of S. suis (SsuiDRAFT 0103, SsuiDRAFT 0174, and SsuiDRAFT 1237), being all of them immunogenic although only one (SsuiDRAFT 0103) induces a significant protective response against a virulent S. suis strain in mice. Moreover, the overexpressed cell wall-associated proteins Ssu0309 and Ssu1103 of the adcR mutant, were identified by mass spectrometry as putative virulence factors belonging to the Pht (Pneumococcal histidine triad) family. Likewise, protective abilities of mutant strains were analyzed showing that although mutant cells are not effective to confer protection in mice, the combination of adcR- and fur-regulated cell wall-associated proteins confers a significant protection against S. suis 89/1591 challenge to mice vaccinated with them.