Estudio de los factores de patogenicidad de Cryptococcus gattii

Abstract

La patología producida por C.gattii, se asemeja en muchos casos a la producida por patógenos primarios, por el hecho de ser capaz de afectar a personas y/o animales inmunocompetentes. La criptococosis por esta especie, hasta ahora ha sido considerada una micosis de mayor prevalencia en países tropicales o sub-tropicales. Al ser considerado Cryptococcus gattii como una nueva especie separada filogenéticamente de C. neoformans y al actuar patológicamente como un patógeno primario infectando sujetos inmunocompetentes; sería posible demostrar diferenciasen sus factores de patogenicidad y en los patrones de sensibilidad con respecto al C. neoformans.<br/>Objetivo<br/>Estudiar en Cryptococcus gattii y C. neoformans serotipos; las características fenotípicas y genotípicas de dos de los factores de patogenicidad considerados mas importantes y analizar los patrones de sensibilidad a los antifúngicos, utilizados para el tratamiento de la criptococosis y a los antifúngicos de última generación.<br/>Materiales y Métodos: Todas las cepas de Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii utilizadas en éste trabajo pertenecen o se encuentran almacenadas en la colección de URMIM, del Institut Municipal de Investigació Mèdica; ubicada en el edificio del Parc de Recerca Biomèdica de Barcelona. Actualmente, las cepas también se encuentran en el laboratorio de Micología, Facultad de Medicina de la Universidad Miguel Hernández en Sant Joan d'Alacant, Alicante.<br/>Resultados y Conclusiones:<br/>Para poder estudiar las diferencias en la actividad ureasa de ambas especies, C. neoformans y C. gattii, se diseñó un método original y reproducible que permitió realizar la cuantificación de esa actividad enzimática. Utilizando ese método in vitro, se comprobó que los aislados de Cryptococcus neoformans presentaban estadísticamente mayor actividad ureasa que las de C. gattii, independientemente del origen de las cepas. Realizando una adaptación de la técnica utilizada par medir la actividad fenoloxidasa de Mycobacterium leprae, fue posible analizar cuantitativamente la producción de esta enzima a partir de cultivos puros de C. gattii aislados de cabras, comparándolos con cepas de referencia de la misma especie y de C. neoformans. Los resultados obtenidos demostraron que, en conjunto, C. gattii presentaba in vitro mayor actividad lacasa (fenoloxidasa) que C. neoformans. Las tres cepas con mayor producción de lacasa fueron los agentes de otros tantos brotes epidémicos de criptococosis en cabras, sugiriendo que esta enzima tiene un papel destacado en la virulencia de C. gattii. El estudio molecular de cepas seleccionadas de C. gattii demostró que el gen CNLAC1 de esta especies, presenta una región exclusiva en sus dos serotipos B y C. Se pudo demostrar in vitro que la región identificada en el gen CNLAC 1, es utilizada en la trascripción de la expresión de la enzima lacasa, específicamente en C. gattii serotipos B y C. Utilizando un método de microdilución estandarizado de referencia, las 80 cepas de C. neoformans y de C. gattii, evaluadas resultaron sensibles a los tres antifúngicos estudiados, fluconazol, voriconazol y posaconazol. Las CMI de los dos últimos triazoles fueron muy similares, no superando los 0,5 &#956;g/mL. Se analizó la concentración mínima fungicida de estas cepas a los tres<br/>triazoles, comprobándose que resultados equivalentes a los de las CMI. A pesar de que el posaconazol presentó mayor actividad que los otros azoles, no se hallaron diferencias estadísticamente significativas en los resultados obtenidos entre las dos especies de Cryptococcus, ni entre sus serotipos. Se evaluó la utilidad del método Etest como alternativa al micrométodo, para determinar las CMI del posaconazol en C. gattii y C. neoformans, encontrándose un buen nivel de concordancia entre ambos métodos. La elevada sensibilidad de ambas especies de Cryptococcus al posaconazol, sugieren que este nuevo antifúngico puede ser una alternativa terapéutica en el tratamiento de la criptococosis.

Criptococcus gattii produced an infectious disease in immunosuprised mammals. In the last years this mycosis has been show a high prevalence in tropical and subtropical countries. This new specie, C. gattii, it is already philogenetic separated from C. neoformans and it is considered a real pathogen from human and animals. In this work, we have been study differences among virulence factors and in vitro susceptibility in both, C. neoformans and C. gattii.<br/>Objective: <br/>Demonstrate differences phenotypic and genotypic of laccase and urease enzymes between C. neoformans and C. gattii. Analyze in vitro susceptibility of fluconazole (FNZ), voriconazole (VNZ) and posaconazole (PNZ) of both species of Cryptococcus.<br/>Materials and methods: <br/>All strains used in this work were from a private collection of Laboratory of Infectious disease and Mycology (URMIM) in Barcelona. <br/>Results and Conclusions: <br/>The original method for determinate the urease activity in C. neoformans and C. gattii, showed high activity of urease in 76% of C. neoformans and 15.6% of C. gattii, by the other hand, the methodology for determinate laccase activity showed more laccase in C. gattii than C. neoformans. <br/>The molecular study of 55 strains of Cryptococcus showed a specific fragment of CNLAC1 gene, exclusive in C. gattii B and C serotypes, totally absent in C. neoformans. In this work, have been demonstrated the in vitro transcription of the fragment of 500bp in the laccase synthesis.<br/>Using a CLSI M27-A2 microdilution method for susceptibility of FNZ, VNZ and PNZ, 80 strains of Cryptococcus were study. The minimal inhibitory concentration (MIC) of VNZ and PNZ were < 0,5 &#956;g/mL. The minimal fungicidal concentration (MFC) was determined. MFC and MIC were homogeneous in all three antifungics. Non statistical significance results were show between the two species or among the four serotypes.