Estudio de los genes implicados en el metabolismo del arsénico en cultivos y en sistemas naturales

Abstract

La presencia de arsénico en aguas potables y de riego es un problema económico, social y ambiental de extrema importancia, especialmente en varios países de América Latina (principalmente en el Norte de Chile y de Argentina). Los microorganismos respiradores que reducen As(V) a arsenito As(III) son diversos y pueden estar implicados en la movilización del arsénico del sedimento a fuentes de agua potable. Para entender cómo contribuye este metabolismo a la biogeoquímica del arsénico la presente tesis explora, por un lado, tanto la diversidad de comunidades microbianas en ambientes naturales salinos con presencia (p.ej. el Salar de Ascotán) o ausencia (Laguna Tebenquiche) de arsénico, como la distribución y diversidad de los genes involucrados en este metabolismo (arsenato reductasa arrA y arsC) y, por el otro, el aislamiento y caracterización de cultivos puros y su implicación en la formación de minerales sulfurosos de arsénico en estos ambientes salinos.<br/>Con la construcción de bibliotecas genéticas se pudo caracterizar la diversidad microbiana del gen ribosómico 16S rRNA, encontrando diferencias marcadas entre las bacterias presentes en ambientes salinos con y sin arsénico. La diversidad de genes involucrados en la reducción del As(V), se estudió con cebadores específicos descritos en estudios previos pero optimizando su aplicación a muestras naturales con contenidos elevados de arsénico. Se estudió el gen arrA presente en microorganismos que respiran arsenato y lo reducen a arsenito y el gen arsC que está ligado a la detoxificación del arsénico denle el citoplasma y su expulsión mediante bombas de excreción ligadas a la membrana. La mayoría de las secuencias recuperadas formaron grupos nuevos pero relacionados con los clones obtenidos en ambientes similares pero de menor concentración de arsénico reportados en la literatura, y emparentados con el grupo Firmicutes. Observamos que, tanto por el estudio de los genes 16S rRNA como de los genes funcionales de As, los grupos más abundantes siempre fueron Firmicutes y Gammaproteobacteria en muestras de agua y de sedimento del Salar de Ascotán.<br/>En un conjunto de muestras naturales con diferentes concentraciones de arsénico encontramos una relación entre la concentración de arsénico y la presencia, mediante la técnica del número más probable, de bacterias reductoras de arsénico muy abundantes a mayores concentraciones y ausentes a bajas concentraciones. La presencia del gen arrA se detectó a lo largo de todo el gradiente. En cambio, el gen arsC sólo fue encontrado en muestras con bajas concentraciones de arsénico. Estos datos indican la presencia en estos sistemas de bacterias relacionadas con la reducción del arsénico sugiriendo un papel importante en su movilización a fuentes de aguas naturales.<br/>Finalmente, los estudios de cultivos de enriquecimientos y aislamiento de cepas procedentes del Salar de Ascotán, nos permitió disponer de una nueva cepa del genéro Shewanella capaz de reducir As y sulfato en forma anaeróbica, una peculiaridad que la diferencia de otras Shewanella spp. aisladas previamente de ambientes contaminados con arsénico. Además, estos estudios nos ayudaron a comprender mejor el ciclo biogeoquímico del arsénico a nivel geológico, ya que se demostró que la presencia y actividad de bacterias reductores de arsenato está ligada a la formación de minerales sulfurados de arsénico a gran escala, confirmando el origen biológico de estos minerales.

Presence of arsenic in drinking and irrigation waters is a serious concern of great economic, social, and environmental importance in numerous locations across South America (mainly in the Northern Chile and Argentina). As respiring microorganisms that reduce As(V) to As(III) are diverse and can be involved in the As mobilization from the sediment to drinking water sources. The present PhD thesis explores the links between the microbial metabolism and the biogeochemical cycling of As in saline systems of Northern Chile. On the one hand, the microbial diversity and the distribution and diversity of arsenic functional genes (i.e., arsenate reductases arrA and arsC) were studied in saline environments with high (e.g., Salar de Ascotán) and low (e.g., Laguna Tebenquiche) As concentrations. On the other hand, characterization of microbial enrichments and bacterial pure cultures were carried out to link bacterial activity and the origin of arsenic minerals in the environment. <br/>The 16S rRNA gene clone libraries showed consistent differences in bacterial community composition in saline environments with high and low concentrations of As. As functional genes were amplified with specific primers previously described in the literature and methodological improvements were conducted in this work to optimize the amplification in hypersaline, As-rich natural samples. The gen arrA is present in anaerobic microorganims that respire As (V) to As (III). The gen arsC, in turn, is used for detoxification trough membrane pumps. Most of the sequences found formed new clusters distantly related to previously known sequences obtained from environments with presence of As, within the Firmicutes. Both 16S rDNA and arsenic functional genes showed Firmicutes and Gammaproteobacteria as the predominant bacterial groups in water and sediment samples of Salar de Ascotán.<br/>Along a set of natural samples with increasing arsenic concentrations we found a positive relationship between arsenic concentration and abundance of arsenic reducing bacteria determined by MPN. The gen arrA was detected throughout the gradient. Conversely, the gen arsC was only found in the samples with the lowest arsenic concentrations. These data showed a widespread occurrence of bacteria related to the arsenic cycling, suggesting a key role of arsenic reducing bacteria in the arsenic mobilization to the aqueous phase.<br/>Finally, through classical microbiology studies we obtained a new strain of Shewanella from sediments of Ascotán that reduced both As and sulfate under anaerobic conditions, a specific trait not previously reported in other Shewanella spp isolated from environments contaminated with arsenic. In addition, these studies gave further clues for a better comprehension of the arsenic cycle at the geological level. We showed that the presence and activity of arsenic reducing bacteria was linked to the formation of sulfurous arsenic minerals at a large scale, giving further evidence for the biological origin of the wide arsenic mineral layers found in Salar de Ascotán.