Optimizaciones metodológicas del ensayo del cometa y su aplicación en biomonitorización humana

Abstract

La integridad del DNA es un aspecto fundamental para la salud y el buen funcionamiento de nuestro organismo. Sin embargo, sabemos que el material genético es susceptible de ser dañado por numerosos agentes y/o procesos. Aunque la mayoría del daño que se produce en nuestro material genético es separado eficientemente, parte de él escapa a este proceso constituyendo uno de los sustratos para el potencial desarrollo de un proceso carcinogénico. <br/>En los últimos años, se han desarrollado con éxito nuevas metodologías capaces de evaluar el daño en el DNA, diseñándose técnicas que permiten medir directamente roturas de cadena simple (SSB) y de doble cadena (DSB) en el DNA. Entre ellas, el ensayo del cometa se ha convertido en una de las más populares para la evaluación de este tipo de daño. <br/>Aunque el ensayo del cometa se ha propuesto como una herramienta apropiada, todavía existen muchos aspectos que deben reconsiderarse, por lo que el objetivo principal de este trabajo de Tesis fue la optimización del ensayo del cometa como biomarcador de daño en el DNA y su aplicación tanto en radiobiología, mediante la construcción de una curva de calibración, como en la biomonitorización de dos cohortes de madres e hijos de dos localidades de Barcelona. <br/>Las metodologías del ensayo del cometa que se aplican en los diferentes laboratorios son variadas pero, sin duda alguna, la versión alcalina es la más utilizada. A pH >13, la técnica resulta más sensible para la detección de niveles bajos de daño, por lo que la hemos elegido como versión estándar. Se desarrollaron numerosos experimentos con modificaciones que optimizaron el ensayo en aspectos como: el soporte utilizado, que permitió la manipulación de un elevado número de muestras en un mismo ensayo; la utilización de enzimas de reparación para la detección de daño oxidativo, y la criopreservación para el almacenamiento masivo de muestras valorables mediante el ensayo. <br/>En cuanto a las aplicaciones, la construcción de una curva de calibración resulto ser un gran aporte ya que con ella se pudo establecer el daño genético basal de una población, en términos de roturas/109 Da de DNA. Además, se ha puesto de manifiesto que la radiosensibilidad individual puede ser medida con el ensayo de cometa, lo que respalda a la técnica como un buen indicador de inestabilidad genómica individual. <br/>Finalmente, en el área de la biomonitorización humana, se encontró una fuerte correlación, tanto en el daño basal como oxidativo, entre madres e hijos; aunque, no se pudo establecer fehacientemente una influencia significativa de ninguno de los factores de confusión considerados. Esto pone en evidencia los problemas asociados con la reciente inclusión del ensayo del cometa en los estudios de biomonitorización, por lo que surge la necesidad de desarrollar estudios específicos que tengan como objetivo principal la determinación de aquellos factores que puedan incidir significativamente en los niveles de daño en el DNA de poblaciones humanas.

The DNA integrity is a fundamental aspect for human health and for the suitable <br/>functions of our organism. However, the genetic material is susceptible to be damaged by many agents and processes. Although the majority of damage induced in our genetic material is repaired efficiently, a part of this damage escapes from this process and becomes one of the substrates for the potential development of a carcinogenic process. <br/>During the last years new methodologies have been developed to assess the DNA damage by performing techniques which allow to measure single strand breaks (SSB) and double strand breaks (DSB) directly. The comet assay has become one of the most popular approaches to evaluate this type of damage. Although this technique has been proposed as an appropriate tool, many aspects must be still reconsidered. For this reason, the aim of this Thesis was to contribute to the optimization of the comet assay as a biomarker of DNA damage and its application in radiology, by means of the construction of a calibration curve and, also, biomonitoring of two cohorts composed by mothers and newborns recruited from two hospitals of the Barcelona province.<br/>The methodologies of the comet assay, which are applied in the different <br/>laboratories, are variable but, with no doubt, the alkaline version is the most used. This technique is more sensitive to detect lower levels of damage at pH>13. For this reason, we have chosen it as the standard version to be used in our study. We have developed numerous experiments with modifications which have optimized the assay in three aspects: the type of support utilized, which allows the manipulation of many samples in the same experiment; the use of repair enzymes in order to detect the oxidative damage; and the cryopreservation to keep many samples which can be properly evaluated in the assay.<br/>As regards the applications, the construction of a calibration curve was an important contribution because, with its use we have been able to establish the basal genetic damage of the population, in terms of breaks /109 Da DNA. Moreover, it has been proposed that the individual radiosensitivity can be measured with the comet assay. This supportsthat this technique is a satisfactory indicator of individual genomic instability.<br/>Finally, in the area of human biomonitoring, we have found a strong correlation for both the DNA basal damage and oxidative damage between mothers and children; but we couldn't clearly establish a significant influence of any of the confusion factors that has been considered in this study. This evidence has revealed related problems with the recent use of comet assay in biomonitoring studies, and has resulted in the necessity to develop specific studies in order to determine these factors, which can influence significantly on the levels of DNA damage in human populations.