Paper del moviment de les hèlixs en l’estructura i funció de la bacteriorodopsina

Abstract

La bacteriorodopsina (bR) és una proteïna transmembrana amb 7 hèlixs α (7TM) anomenades de la A a la G amb un retinal unit a través d’una Base de Schiff a la Lys216 en l’hèlix G. La proteïna és nativa de l'arqueobacteri halòfil Halobacterium salinarum i es troba formant membrana púrpura, una estructura paracristal·lina formada per hexàmers de trímers de bR. La bR utilitza l’energia de la llum per a transportar protons contra gradient utilitzant l’absorció d’un fotó pel retinal, absorció que desencadena una serie de canvis estructurals que condueixen a l’alliberament d’un protó al costat extracel·lular i la captació d’un nou al costat citoplasmàtic, és l'anomenat fotocicle. Els diferents canvis estructurals donen lloc a intermediaris amb unes longituds d’ona d’absorció màxima i uns canvis conformacionals característics i se’ls anomena amb lletres de la K a la O per ordre de formació. Tot el fotocicle es completa en uns 10 mil·lisegons. La bR ha sigut molt ben estudiada al llarg dels anys i ha servit com a model d’estudi de proteïnes de membrana, de GPCRs i de bombes de protons, però hi ha aspectes que romanen sense explicar o no hi ha consens. Un d’ells és el paper del moviment de les hèlixs en el correcte funcionament de la bR, ja que estudis de Ressonància Paramagnètica Electrònica (EPR) i estructures de raigs X han mostrat desplaçaments d’hèlixs durant el fotocicle però també s’ha proposat que aquests no serien necessaris per a la seva funció. Per esbrinar el paper del seu moviment, en aquest treball s’han construït mutants dobles de cisteïna en diferents hèlixs per a la seva fixació mitjançant ponts disulfur i el seu estudi mitjançant principalment tècniques espectroscòpiques. Així, comparant la proteïna silvestre (wild type, WT) amb el doble mutant amb les cisteïnes reduïdes es podrà veure l’efecte (o no) de les mutacions i treballant en condicions oxidants es formen ponts disulfur entre els residus de cisteïna fixant ambdós hèlixs i permetent l’estudi de la proteïna sense el moviment d’aquestes hèlixs. En aquest treball s’han estudiat els dobles mutants T157C/K172C i A160C/A168C per al moviment de les hèlixs E i F, el V101C/M163C per a fixar el bucle EF a l’hèlix C, el L13C/L61C per a les hèlixs A i B i el K129C/F71C per als bucles BC i DE. Els tres primers es troben al costat citoplasmàtic de la proteïna i els dos últims en el costat extracel·lular. Les mutacions introduïdes al costat citoplasmàtic no afecten significativament a l’estructura de la bR. La fixació del bucle EF a l’hèlix C redueix significativament el rendiment del transport de protons mostrant que el moviment del bucle és important per al correcte funcionament de la bR. Les mutacions del costat extracel·lular han afectat tant a l’estructura com a la funció de la bR mostrant que la zona extracel·lular és molt sensible a les mutacions. Aquests mutants presenten alteracions en la butxaca d’unió del retinal i el transport de protons està fortament disminuït, sent de tan sols el 6,5% del natiu en el mutant L13C/L61C reduït. Els mutants K129C/F71C i K129C en films i en condicions d’humitat baixa i pH 10 presenta un intermediari M amb una vida mitjana de l’ordre de minuts, mentre que en WT dura mil·lisegons. Proposem possibles aplicacions biotecnològiques per a aquests mutants, com la construcció de memòries basades en bR utilitzant el fotocromisme entre l’estat basal de la bR i aquest intermediari M de vida llarga.

Bacteriorhodopsin (bR) is a 7 helix membrane protein (7TM) named from A to G with a retinal covalently bound through a Schiff Base (SD) to the Lys216 located in helix G. The protein is found in the halophilic archaea Halobacterium salinarum forming purple membrane, a paracrystalline structure composed by hexamers if bR trimers. bR uses the energy of retinal photon absorption to transport protons across the membrane against the gradient. The photon absorption causes several structural changes during the called photocycle which result is a proton release at the extracellular medium and the uptake of a proton from the cytoplasmic space. During the photocycle bR undergoes through different photointermediates with characteristic structural changes and maximum absorption wavelengths. The different photointerediates are named from K to O in order of formation. The photocycle takes 10 ms to complete. bR has been studied for decades and used as a model to study membrane proteins, GPCR and proton pumps, but some aspects remain unclear. One of this aspects is the role of helix movement in the proper functioning of the protein, because X-ray crystallography and Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) studies showed helix displacement during the photocycle but other works suggested that this movements are not essential. To check the role of helix movement, we constructed cysteine double mutants placed at different helix to fix them using disulfide bridges and we studied the mutants using mainly spectroscopic technics. So, comparing the wild type protein with double mutant with and without disulfide bridge formation the effect of mutations and restriction of helix movement is studied. The double cysteine mutants constructed are: T157C/K172C and A160C/A168C to fix helices E and F, V101C/M163C to fix loop EF and helix C, L13C/L61C for helices A and B and K129C/F71C to fix the loops BC and DE. The first three mutants are located at cytoplasmic side and the last two at extracellular side. The cytoplasmic mutations do not affect significatively to bR structure. Fixation of loop EF and helix C strongly diminishes proton transport showing that loop movement is important for proton pumping. Extracellular mutants affect to structure and function of bR showing that bR extracellular side is very sensitive to mutations. These mutants present alterations in retinal binding pocket (RBP) and the proton transport is strongly affected, being in L13C/L61Cred only the 6,5% of proton transport in WT. Mutants K129C/F71C and K129C in films at pH10 and low humidity lead to formation of long-live M intermediate with a half-life of minutes instead of milliseconds in the case of WT. Biotechnological applications like bR-based memories are proposed, using the photochromism between bR basal state and the long-live M intermediate.