Noves tecnologies per al diagnòstic molecular de la sèpsia

Abstract

La sèpsia és la resposta sistèmica de l’organisme, en la que es produeixen un conjunt de canvis humorals i cel·lulars, com a resposta a la invasió sanguínia per microorganismes i/o les seves toxines. En l’evolució clínica del pacient intervindran diferents factors com les característiques del microorganisme (inòcul, virulència), la immunocompetència de l’hostatger (patologia de base, factors genètics,...) i la rapidesa en administrar el tractament antibiòtic i de suport adequats. Degut a l’augment de l’expectativa de vida i dels tractaments i manipulacions exploratòries cada vegada més agressius, la incidència de sèpsia s’incrementa any darrere any. Aquesta síndrome té una mortalitat elevada, essent-ne la primera causa a la Unitats de Cures Intensives. A més a més, s’ha demostrat que aquesta s’incrementa en els malats que reben un tractament antibiòtic inadequat. Per tant, la rapidesa en l‘obtenció del diagnòstic microbiològic és crucial per a la disminució de la mortalitat. Actualment, el mètode de referència (gold standard) per al diagnòstic microbiològic de la sèpsia continua sent l’hemocultiu. La seva principal limitació és la mitjana de 15 hores d’incubació per a l’obtenció d’un resultat positiu i després, de 24-48 hores més per a la identificació i l’antibiograma, el que pot implicar un retard en l’aplicació d’una teràpia antibiòtica efectiva. A més a més, en els malalts en que ja s’ha administrat alguna dosi d’antibiòtic prèviament a la inoculació de l’hemocultiu, el rendiment de les tècniques microbiològiques convencionals és baix, el que fa que, en moltes ocasions, no s’arribi al diagnòstic etiològic i, per tant, es desconegui la sensibilitat als antibiòtics del microorganisme causant de la sèpsia. Tot i que fa diversos anys que existeixen assajos moleculars comercialitzats per a aquesta finalitat, només un (SeptiFAST, Roche, Manheim, Alemanya) ha estat extensament avaluat en l’àmbit hospitalari donant resultats variables i encara no ha estat àmpliament implementat. En aquesta tesi doctoral s’ha avaluat la utilitat de la tecnologia PCR/ESI-MS per al diagnòstic molecular de la sèpsia. Aquesta tècnica es basa en una PCR d’ampli espectre seguida d’una espectrometria de masses d’ionització per electrospray i permet la identificació de bacteris i fongs a partir de mostra directa en unes 6 h. Durant l’avaluació de la primera versió (PLEX-ID), es van obtenir resultats prometedors però la sensibilitat de l’assaig era moderada (43,5%) en comparació amb els mètodes convencionals de diagnòstic. Tot i això, aquesta tecnologia va ser capaç de detectar fins a 12 microorganismes clínicament significantius que no van ser aïllats per l’hemocultiu. Degut a la baixa sensibilitat, es va redissenyar la tecnologia. La nova versió, anomenada IRIDICA, presenta com a canvi més important la utilització de 5 mL de sang (en comparació dels 1,250 mL utilitzats amb el PLEX-ID). Amb la nova versió de la tecnologia s’ha obtingut una sensibilitat del 73% en comparació amb els mètodes convencionals. A més a més, IRIDICA va detectar fins a 41 microorganismes clínicament significatius en pacients amb hemocultiu negatiu, la majoria dels quals ja havien rebut tractament antibiòtic. Aquesta tesi també explora la utilitat d’aquesta tècnica en diferents tipus de pacients. Es van analitzar mostres de pacients provinents del Servei d’Urgències i de pacients ingressats a la Unitat de Cures Intensives. En aquest últim grup, IRIDICA va demostrar una millor sensibilitat (83,0%) en comparació als mètodes convencionals. Aquests resultats són concordants amb un estudi multicèntric recentment publicat on s’avalua aquesta tècnica per al diagnòstic molecular de la sèpsia en malats crítics i que inclou pacients diferents Unitats de Cures Intensives de sis països europeus. Per tant, IRIDICA és un sistema robust, ràpid i fiable per a la detecció de microorganismes en sang total i que ha demostrat que incrementa el nombre de casos de sèpsia confirmada microbiològicament incloent els pacients que ja estan en tractament amb antimicrobians. La utilització d’aquest sistema tindria més rellevància en malalts crítics ja que permetria una identificació precoç del microorganisme causant de la sèpsia. Per tant, es podria adequar abans el tractament antibiòtic, millorant la taxa de supervivència i el maneig del pacient.

Sepsis is a systemic response of the organism to the invasion by microorganisms and/or their toxins in the blood, characterized by a variety of humoral and cellular changes. Several factors will influencethe clinical outcome of the patient, such as the characteristics of the microorganism (inoculum, virulence), immunocompetence of the host (pathology, genetic factors, etc.) and the time elapsed until the administration of antibiotic treatment and appropriate support. Due to increased life expectancy and more aggressive treatments and exploratory manipulations, the incidence of sepsis increases year after year. This syndrome has a high mortality, being the first cause of death in the Intensive Care Unit. Moreover, it has been shown that the mortality is higher in patients receiving inadequate antibiotic treatment. Therefore, obtaining a rapid microbiological diagnosis is crucial in order to decrease mortality. Currently, the reference method (gold standard) for the microbiological diagnosis of sepsis is blood culture. Its main limitation is the average of 15 hours of incubation needed to obtain a positive result, and another 24-48 hours are needed for the identification and the antimicrobial susceptibility testing, which may cause a delay in the implementation of an effective antibiotic therapy. Furthermore, in patients who are already under antibiotic treatment prior to the inoculation of the blood culture, the performance of conventional microbiological techniques is lower, which means that, in many cases, the etiological diagnosis cannot be obtained and, therefore, the sensitivity to antibiotics of the microorganism causing sepsis is not known. Although there are several molecular assays commercially available, only SeptiFAST (Roche, Mannheim, Germany) has been extensively evaluated in the hospital setting showing heterogeneous results and has not been widely implemented yet. This thesis has evaluated the usefulness of the technology PCR/ESI-MS for the molecular diagnosis of sepsis. This technique is based on a broad spectrum PCR followed by mass spectrometry electrospray ionization and is able to identify bacteria and fungi from direct specimens in about 6 hours. During the evaluation of the first version of this technology (PLEX-ID) promising results were obtained but its sensitivity was moderate (43.5%) in comparison with the conventional diagnostic methods. On the other hand, this technology was able to detect up to 12 clinically significant microorganisms that were not isolated by blood culture. However, because of its suboptimal sensitivity, the technology was refurbished. The new version, named IRIDICA, presents, as a major change, the increase of the volume of blood analyzed up to 5 mL (in comparison with the 1.250 mL used for the PLEX-ID). With the new version, the technology achieved a sensitivity of 73.0% in comparison with conventional methods. Furthermore, IRIDICA detected up to 41 clinically significant microorganisms in patients with negative blood culture, most of whom had previously received antibiotic treatment. This thesis explores the usefulness of this technique in different types of patients. We analyzed samples of patients from the Emergency Room and patients admitted to the Intensive Care Unit. In the latter group, IRIDICA showed a higher sensitivity (83.0%) in comparison with conventional methods. These results are concordant with a recently published multicentric study that evaluated this technique for the molecular diagnosis of sepsis in critically ill patients admitted to the Intensive Care Units from six European countries. In conclusion, IRIDICA is a robust, rapid and reliable technology for the detection of microorganisms directly from whole blood. This technology would increase the number of microbiologically confirmed sepsis cases, even in the presence of antimicrobial treatment. The utilization of this system would provide an early identification of the microorganism causing sepsis, with an improved performance in critically ill patients. Therefore, IRIDICA would lead to a prompter administration of the antimicrobial treatment, thus improving the survival rate and patient management.