Quantitative analysis of HER family proteins using mass spectrometry as a predictive tool of response to anti-HER therapies in breast cancer

Abstract

Introducción: La expresión desregulada y la actividad de los miembros de la familia HER es frecuente en el cáncer de mama (CM). Hasta el 25% de CM sobreexpresan HER2. Los altos niveles de este oncogén, casi invariablemente como consecuencia de la amplificación genómica, conllevan una enfermedad agresiva y es una importante diana terapéutica. Los anticuerpos monoclonales y las pequeñas moléculas inhibidoras de quinasa son las principales estrategias dirigidas contra HER2 en CM. Aunque el tratamiento con trastuzumab se asocia con importantes beneficios en términos de supervivencia, un número significativo de pacientes con CM HER2-positivo no se benefician de ella o se vuelven resistentes. Otros fármacos anti-HER2 (por ejemplo, lapatinib, pertuzumab y T-DM1) han sido aprobados para el tratamiento de CM metastásico HER2-positivo después de la progresión a trastuzumab. Estos nuevos fármacos anti-HER2 están siendo probados en el tratamiento adyuvante, solo o en regímenes de anticuerpos duales sin quimioterapia concomitante o secuencial. Identificar qué pacientes con CM tienen más probabilidades de beneficiarse de una u otra forma de terapia dirigida anti-HER es crucial. Los métodos actuales para la determinación del estado de HER2 (IHC y FISH) son semicuantitativos, sufren de problemas de reproducibilidad, y no predicen la respuesta al trastuzumab. El objetivo principal de este proyecto fue investigar si el análisis cuantitativo de la proteína HER2 por espectrometría de masas (MS) puede mejorar la predicción actual de respuesta o resistencia a los medicamentos dirigidos contra HER.

Métodos: Hemos cuantificado mediante MS los niveles de proteína HER2 en muestras de tejido, fijados en formol e incluidos en parafina que habían sido clasificadas como negativas (HER2 0, 1+), equívoca (2+) o positiva (3+) por inmunohistoquímica (IHC). Las curvas ROC (Característica Operativa del Receptor) se construyeron mediante el cálculo de la sensibilidad y especificidad de cantidades crecientes de HER2 (por MS) en la predicción de positividad de HER2 (por IHC/ISH combinado) y de beneficio en la supervivencia después de tratamiento con anti-HER2. El análisis de supervivencia se llevo a cabo con el método de Kaplan-Meier y las curvas se compararon mediante el test del Log-Rank. Para el análisis multivariable se utilizó la regresión de Cox ajustado por el estado de los receptores hormonales, el estadío del tumor, los ganglios linfáticos y los niveles de HER2 por MS. Los resultados se consideraron significativos cuando los valores de p (p) fueron menos de 0,05.

Resultados: Los niveles absolutos de HER2 (amol/μg) se correlacionaron significativamente con HER2 por IHC y el estado de la amplificación por ISH (p <0,0001). Dentro de la categoría de IHC-positivos (3+), se observó un amplio rango dinámico de la expresión de la proteína HER2 (de 163,7 a 17,446.7 amol/μg). Utilizando el punto de corte de 740 amol/μg, la tasa de correlación entre HER2 por MS y estándar IHC/ISH fue del 94% (p <0,0001). Los casos discordantes (MS-negativo/ISH-positivo) mostraron un patrón de amplificación característica conocida como “doble minutes” (DM). Los pacientes con niveles de HER2 por MS por encima de 2200 amol/μg (super-expressors) tuvieron un tiempo de supervivencia libre de enfermedad (DFS) y una supervivencia global (OS) mas largas después de tratamiento adyuvante y un OS mas largo en línea metastásica. Ni HER2/CEP17 ni tampoco HER2 GCN fueron predictivos de DFS después de tratamiento adyuvante.

Conclusión: Una cuantificación precisa de la proteína HER2 se puede lograr utilizando la MS y puede llevarse a cabo en muestras de tejido FFPE clínica de los pacientes con CM. La medición cuantitativa de HER2 por MS se correlaciona con la expresión de la proteína por IHC, pero proporciona un rango dinámico más amplio, destacando así la resolución limitada de la IHC diagnóstica. No todos los tumores ISH-positivos muestran expresión alta de la proteína HER2 a pesar de ser IHC 3+. Los tumores amplificados en DM tienen niveles de la proteína HER2 significativamente más bajos en comparación con aquellos con patrón de “homegenously stained regions”. La MS es superior a IHC e ISH en predecir la supervivencia después del tratamiento con terapia anti-HER2. Los pacientes cuyos tumores expresan la proteína HER2 a niveles de > 2200 mg amol/μg obtienen un beneficio más grande tras el tratamiento con la terapia anti-HER2 que los pacientes con bajos niveles de expresión de HER2.

Introduction: Dysregulated expression and activity of HER family members is frequent in breast cancer (BC). Up to 25% of BC overexpress HER2. High levels of this oncogene, almost invariably as a consequence of genomic amplification, drives aggressive disease and is an important therapeutic target. Monoclonal antibodies and small molecules kinase inhibitors are the main strategies to target HER2 in BC. Although trastuzumab treatment is associated with considerable benefits in terms survival outcomes, a significant number of patients with HER2-positive BC do not benefit from it or become resistant. Other HER2-targeted drugs (eg, lapatinib, pertuzumab, and T-DM1) have been approved for the treatment of HER2-positive metastatic BC after progression on trastuzumab. These new HER2-targeted drugs are now being tested in the adjuvant setting, alone or in dual antibody regimens without concomitant or sequential chemotherapy. Identifying which patients with BC are most likely to benefit from one or another form of anti-HER targeted therapy is crucial. Current standard methods for the determination of HER2 status (IHC and FISH) are semiquantitative, suffers from reproducibility issues, and do not predict response to trastuzumab. In the present study we sought to investigate if quantitative analysis of HER2 by mass spectrometry (MS) may improve current prediction of response or resistance to HER-targeting drugs. Methods: Using selected reaction monitoring MS, we quantified HER2 protein levels in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples that had been classified as negative (HER2 0, 1+), equivocal (2+) or positive (3+) by immunohistochemistry (IHC). Receiver operating characteristic (ROC) curves were constructed by computing the sensitivity and specificity of increasing quantities of HER2 (by MS) in predicting HER2 positivity (by combined IHC/ISH) and of survival benefit after anti- HER2 therapy. Survival was modeled using the Kaplan-Meier curves and the p-value obtained by the log-rank test. Multivariate survival analysis was performed using the Cox proportional hazards model adjusted for hormone receptor status, tumor stage, lymph node status and HER2 SRM levels. Results were considered significant when p-values (p) were less than 0.05. Results: Absolute HER2 amol/μg levels were significantly correlated with both HER2 IHC and amplification status by ISH (p<.0001). Within IHC-positive (3+), a wide dynamic range of HER2 protein expression (from 163.7 to 17,446.7 amol/μg) was present. A HER2 threshold of 740 amol/μg showed an agreement rate of 94% with IHC and ISH standard HER2 testing (p<0.0001). Discordant cases (MS-negative/ISH-positive) showed a characteristic amplification pattern known as double minutes (DM). Patients showing HER2 levels by MS above the threshold of 2200 amol/mg (super-expressors) had a significant longer disease-free survival (DFS) and overall survival (OS) in an adjuvant setting and longer OS in a metastatic setting. Neither HER2/CEP17 ratio nor HER2 GCN was predictive of longer DFS or OS in the adjuvant setting. Conclusion: Accurate HER2 protein quantification can be achieved using MS and can be conducted in FFPE clinical tissue samples from BC patients. Quantitative HER2 measurement by MS correlates with protein expression by IHC but provides a wider dynamic range, thus highlighting the limited resolution of diagnostic IHC. Not all ISH-positive tumors show high HER2 protein expression despite being IHC 3+. Tumors amplified in DM show significantly lower HER2 protein levels compared to those with HSR pattern. MS is superior to IHC and ISH in predicting outcome after treatment with anti-HER2 therapy. Patients whose tumors express HER2 protein level >2200 amol/mg benefit more from anti-HER2 therapy than patients with lower HER2 expression levels.