Anàlisi de la contribució de la varietat somàtica de la histona H1 de Drosophila melanogaster (dH1) a la integritat i estabilitat del genoma

Abstract

A les cèl·lules eucariotes, el DNA es troba unit a unes proteïnes bàsiques anomenades histones formant una estructura nucleoproteica que rep el nom de cromatina. Mitjançant la unió a aquestes proteïnes, el genoma queda altament empaquetat possibilitant que hi càpiga en el diminut espai del nucli cel·lular. La unitat estructural bàsica de la cromatina és el nucleosoma. Aquest està format per 146 pb de DNA que s’enrotllen al voltant d’un nucli proteic octamèric format per 2 còpies de cadascuna de les histones H2A, H2B, H3 i H4. A banda d’aquestes histones que conformen el nucli proteic del nucleosoma, també existeix una histona addicional, coneguda com a histona H1, que interacciona amb el DNA als llocs d’entrada i sortida del nucleosoma del DNA, permetent la protecció de 20 pb de bases addicionals. La histona H1 estabilitza el nucleosoma i facilita la compactació de la fibra nucleosomal en estructures de major complexitat. La biologia de la histona H1, però, resta poc estudiada. Malgrat durant molt temps ha estat considerada un repressor general de l’expressió gènica, estudis recents a Drosophila han posat de manifest que això no és del tot cert i han contribuït a revelar noves funcions importants en l’estabilitat del genoma i el desenvolupament.

En aquesta tesi doctoral, es demostra que la histona H1 de Drosophila melanogaster (dH1) prevé l’acumulació d’R-loops i la inestabilitat genòmica a l’heterocromatina. En primer lloc, s’ha observat que les cèl·lules SL2 de Drosophila melanogaster deplecionades d’histona dH1 presenten un increment de la fosforilació de la variant H2Av a la serina 137 (γH2Av), senyal epigenètica associada a la presència de dany al DNA. En relació amb això, també s’ha vist que aquestes cèl·lules presenten una elevada inicidència de trencaments al DNA i intercanvis entre cromàtides germanes. En segon lloc, s’ha vist que aquests defectes tenen lloc preferentment a l’heterocromatina i són deguts a l’acumulació d’R-loops, unes estructures de triple cadena d’àcids nucleics compostes per un híbrid RNA:DNA i una cadena desplaçada de DNA de cadena senzilla que representen una font important d’inestabilitat genòmica. En tercer lloc, mitjançant l’anàlisi del contingut en R-loops i fosforilació d’H2Av a la serina 137 (γH2Av) al llarg del cicle cel·lular, també s’ha observat que en deplecionar la histona dH1 es formen R-loops durant la fase G1 del cicle cel·lular i que la generació de dany al DNA té lloc preferentment durant la fase S, és a dir, durant la replicació del DNA. En relació amb això últim, s’ha vist que la replicació del DNA està afectada i que aquesta afectació és deguda a la presència d’R-loops. Concretament, la replicació del DNA és més lenta i presenta una tendència més alta a aturar-se en aquestes condicions. Finalment, els resultats obtinguts també demostren que la prevenció de l’acumulació dels R-loops a l’heterocromatina podria tractar-se d’una funció específica de la histona dH1, donat que la depleció d’HP1a, un component estructural de l’heterocromatina, no té el mateix efecte. En deplecionar HP1a, no s’observa ni una acumulació d’R-loops ni de dany al DNA.

Per tot això, els nostres resultats inidiquen que la histona dH1 prevé l’estrés replicatiu induit pels R-loops a l’heterocromatina i demostren que la seva contribució és essencial per al manteniment de l’estabilitat del genoma, una funció que està altament compromesa en el càncer i és de vital importancia per a la cèl·lula i la viabilitat de l’organisme.

Linker histone H1 is an intrinsic component of chromatin that plays an important structural role by stabilizing the nucleosome and compacting the nucleofilament into higher-order structures. The biology of histone H1 remains, however, poorly understood. Here we show that Drosophila histone H1 (dH1) prevents genome instability as indicated by the increase of γH2Av (H2Av phosphorylated at Ser137) and the high incidence of DNA breaks (DBs) and sister-chromatid exchanges (SCE) observed in dH1depleted cells. These defects occur at heterochromatin and are due to the accumulation of R-loops, DNA:RNA hybrids that are a source of genome instability. We also show that, concomitantly to upregulation of transposons and other heterochromatic DNAs, R-loops form at G1-phase and induce γH2Av during DNA replication. dH1-depleted cells also show abnormally early heterochromatin replication and increased replication fork stalling. Furthermore, our results also suggest that prevention of R-loop-induced genome instability in heterochromatin could be histone dH1 specific, since depletion of HP1a, an intrinsic component of heterochromatin, does not result in the same phenotype. Altogether, our results indicate that linker histone H1 prevents R-loops-induced replication stress in heterochromatin and unveil its essential contribution to maintenance of genome stability, a function that is highly compromised in cancer and is central for cell and organismal viability.