Caracterización molecular del reflejo inflamatorio y modulación de la respuesta inmune frente a infecciones en peces

Abstract

El mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune innato es fundamental, ya que éste debe mantener una respuesta equilibrada frente a los patógenos. En mamíferos, uno de los mecanismos por el cual se mantiene la homeostasis es el reflejo inflamatorio, un circuito neural que modula la respuesta inflamatoria previniendo la posibilidad de una sobreactivación. El primer objetivo de esta tesis fue establecer si el reflejo inflamatorio descrito en mamíferos también estaba presente en otros vertebrados, y para ello nos centramos en su estudio en teleósteos, más específicamente en trucha (Oncorhynchus mykiss). Una pieza clave del sistema del reflejo inflamatorio es el receptor nicotínico de acetilcolina alfa 7 (α7nAChR). La secuencia del receptor α7nACh de trucha está altamente conservada en comparación con otras especies y el análisis filogenético lo agrupa con otras especies de peces. En estudios in vivo, la estimulación intraperitoneal con lipopolisacárido (LPS) y un análogo del ARN de doble cadena (poly (I:C)), aumentan la expresión del receptor α7nACh en diferentes tejidos y, además, modulan los niveles de acetilcolina en plasma y en bazo. Adicionalmente, el receptor se expresa en macrófagos aislados de bazo y de riñón anterior, en ambos casos siendo capaz de unir α-bungarotoxina, un antagonista específico del receptor α7nACh. Nuestros resultados muestran que existe una modulación de la nicotina (un agonista del receptor) en la expresión génica de moléculas inflamatorias en macrófagos frente a una estimulación con poly (I:C) y no con LPS, a diferencia de estudios realizados en mamíferos. Esta modulación se realiza a través del receptor α7nACh, ya que la adición de un antagonista específico, produce una disminución del efecto de la nicotina. En conclusión, los resultados presentados otorgan indicios de la existencia de un sistema de reflejo inflamatorio en peces, con similitudes y diferencias con el sistema descrito en mamíferos.

La mayoría de los teleósteos responden a los patógenos con un potente sistema inmune innato, lo que convierte la modulación de éste, en una buena herramienta para mejorar la capacidad de respuesta de los peces ante una infección. El sistema inmune de los teleósteos puede ser estimulado a través de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), y a su vez, por citoquinas, como potenciadores no específicos. La segunda hipótesis de esta tesis es que nanopartículas proteicas, conocidas como cuerpos de inclusión (CI), pueden ser utilizados como plataformas de entrega de inmunoestimulantes. En este contexto, fueron desarrollados CI con (citoquinas) y sin (proteínas fluorescentes) una función inmunológica en peces. Los CI son internalizados in vitro por hepatocitos del pez cebra (Danio rerio) y por macrófagos de trucha, modulando la expresión génica de genes relacionados con la respuesta inflamatoria. Los resultados de la biodistribución in vivo en trucha mostraron que los CI son acumulados en bazo y en riñón anterior, y son endocitados por células inmunes relevantes como, los macrófagos. Los diferentes

CI producidos y administrados intraperitonealmente, protegen al pez cebra frente a una infección bacteriana letal (Pseudomonas aeruginosa), siendo mayor la protección otorgada por los CI formados por citoquinas. Adicionalmente, los CI mantienen su morfología y función frente a condiciones extremas de pH y temperatura, así como durante la liofilización. Al ser administrados oralmente en truchas, los CI llegan a los dos primeros tramos del intestino y son absorbidos por células presentes en la mucosa intestinal, las cuales, por su localización en la mucosa podrían corresponderse con linfocitos intraepiteliales (IELs). Nuestros resultados sugieren que los CI pueden ser una alternativa a los métodos actuales como plataforma de entrega de inmunoestimulantes y proteínas por vía oral sin necesidad de encapsulación adicional, siendo éste uno de los principales objetivos de la industria de cultivo de peces.

The inflammatory reflex is a neural circuit that modulates the innate immune system response preventing an overactivation. The first hypothesis of this thesis was to establish whether the inflammatory reflex described in mammals was also present in other vertebrates, and we focused on its study in Oncorhynchus mykiss. We cloned and characterised one of the main components of the inflammatory reflex: the alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor (α7nAChR). The in vivo stimulation with LPS and poly (I:C) increased the receptor gene expression in different tissues and, also, modulated acetylcholine levels in plasma and spleen. The receptor was expressed in trout macrophages and was able to bind bungarotoxin, a specific receptor antagonist. Our results showed that nicotine modulates the gene expression of inflammatory genes in macrophages through α7nAChR after the stimulation with poly (I:C). In conclusion, the results provide evidences of evolutionary conservation of the inflammatory reflex in vertebrates.

Teleost respond to an infections with the activation of a potent innate immune system aiming to eliminate pathogens. Thus, the modulation of the innate system would be an excellent target to improve the responsiveness of the fish to an infection. We have been used protein nanoparticles, known as inclusion bodies (IBs) as immunostimulants delivery platform. The IBs were efficiently internalized in vitro by both zebrafish hepatocytes (Danio rerio) and trout macrophages, and when IBs were administered in vivo they accumulated in the spleen and the head kidney of trout. Importantly, the IBs administered by intraperitoneal injection protect zebrafish against a lethal bacterial infection (Pseudomonas aeruginosa). The orally administered IBs were uptaken by cells of the intestinal mucosa. Our results suggest that the IBs could be an attractive alternative to stimulation of the innate immune system and can be administered orally overcoming the harsh conditions of the gastrointestinal tract.