Study of pro-apoptotic protein RTP801 homeostasis and its regulation by NEDD4 in Parkinson's disease

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is characterized by the loss of dopaminergic neurons of the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) and the presence of cytoplasmic protein inclusions named Lewy Bodies. Current treatments are directed principally to ameliorate the clinical manifestations of the disease rather than suppressing the underlying neuron degeneration and death. This is due, in part, to an incomplete understanding of the pathways that lead to neurodegeneration in PD.

RTP801 is induced in cellular and animal models of Parkinson's disease (PD) and is elevated in neuromelanin positive neurons in the Substantia Nigra (SN) of PD patients. In a variety of neuronal systems, RTP801 overexpression or upregulation is sufficient to trigger cell death. This involves a sequential mechanism in which it sequentially inactivates mTOR and survival kinase Akt.

RTP801 is a protein with a very short half-life (2-7 minutes), so it should be strictly and dynamically controlled at post-translational level to precisely modulate mTOR pathway. Hence, elucidating which proteins mediate RTP801 degradation would be a stepping-stone to design new therapies to block neurodegeneration.

NEDD4, is an E3 ubiquitin ligase highly expressed in mammalian neurons that has been directly linked to PD pathogenesis since it has been reported to promote α-synuclein degradation and to be protective against its toxicity.

In this work, we report that NEDD4 contributes to RTP801 protein degradation. We show in neuronal cells that there is a pool of RTP801 degraded via lysosomal pathway. We also demonstrate that both proteins interact and that NEDD4 enhances RTP801 polyubiquitination by preferentially conjugating K63 ubiquitin chains. Importantly, NEDD4 regulates RTP801 protein levels in cultured cells and in a conditional knockout mouse model. We also provide evidence that NEDD4 protects against RTP801 toxicity by mediating its polyubiquitination. Furthermore, NEDD4 levels are decreased in the 6-OHDA PD cellular model and its restoration protects against 6-OHDA-induced cell death by reducing RTP801 protein levels. Moreover, NEDD4 loss of function is toxic in neurons due to RTP801 elevation and the subsequent mTOR/Akt inactivation. A role for NEDD4 in PD is supported by observation of diminished NEDD4 in nigral neurons from postmortem sporadic PD brains. In line with these findings, the NEDD4 signaling inducer NAB2 reduces RTP801 protein levels in control and in 6-OHDA-treated cortical neurons. However, NAB2 is not sufficient to confer protection against 6-OHDA toxicity, because the compound itself represses mTOR signaling pathway compromising cell survival.

RTP801/REDD1 es una proteína pro-apoptótica que se encuentra aumentada en modelos celulares y animales y en muestras humanas de la enfermedad de Parkinson. RTP801 es suficiente y necesaria para promover muerte celular mediante un mecanismo de inhibición de la quinasas de supervivencia mTOR y Akt. NEDD4 es una E3 ubiquitina ligasa que ubiquitiniza proteínas señalizándolas para su posterior degradación. Esta proteína se ha relacionado recientemente con la enfermedad de Parkinson, ya que se ha visto que ubiquitiniza la proteína alfa-sinucleína.

En este trabajo, se ha descrito que la RTP801 es un sustrato de la ubiquitina ligasa NEDD4. Se ha demostrado que ambas proteínas interaccionan y que NEDD4 ubiquitiniza RTP801 con cadenas de ubiquitina del tipo K63, señalizándola para su posterior degradación lisosomal. También, se ha observado que NEDD4 regula los niveles de RTP801 en sistemas neuronales, y que la pérdida de función de NEDD4 es tóxica debido al incremento de RTP801 y la consecuente inhibición de las quinasas mTOR/Akt. De forma interesante, la NEDD4 ectópica es capaz de proteger ante la toxicidad provocada por la sobreexpresión de RTP801 y ante la toxina parkinsoniana 6-OHDA. Además, la proteína NEDD4 se encuentra disminuida en neuronas nigrales de la SNpc de cerebros post mortem con la enfermedad de Parkinson. De forma consistente, el compuesto NAB2, un activador de NEDD4, disminuye los niveles de la RTP801 en neuronas. No obstante, la acción de este compuesto no es suficiente para proteger ante la toxicidad de la 6-OHDA. También, se ha identificado una posible regulación entre las E3 ligasas parkina y NEDD4, que conferiría un grado de complejidad mayor a la regulación de la RTP801.

Diferentes mutantes de la proteína RTP801 han sido generados para estudiar cómo afecta la ubiquitinización a su estabilidad y función. De forma interesante, el mutante RTP801-K185R pierde la función pro-apoptótica de la RTP801, poniendo en relieve que la ubiquitinización en este residuo es crítica para su función. Finalmente, mediante estudios proteómicos se han identificado numerosos interactores de RTP801 putativos, entre los cuáles se encuentra la clatrina y la proteína adaptadora AP-2, sugiriendo un posible papel de la RTP801 en procesos relacionados con la endocitosis mediada por clatrina.