DNA biosensors based on integrated isothermal amplification-detection strategies

Abstract

L'objectiu principal d'aquesta Tesi Doctoral és presentar un enfoc diferent i alternatiu dels sensors d'ADN per dissenyar i fabricar un nou tipus de plataforma que combini l'amplificació amb la detecció d'ADN, alhora que es superen algunes de les limitacions existents del camp. Per aconseguir aquest objectiu, es presenten una sèrie d'estratègies basades en explotar noves vies d'immobilització en fase sòlida i amplificació enzimàtica per aconseguir millors límits de detecció mitjançant assajos ràpids i fàcils d'executar. El treball exposat representa un mètode ràpid, simple i fàcil d'integrar alhora que és una plataforma de biodetecció que aporta noves idees per a la integració dels assajos d'ADN en dispositius d'intervenció en el llocs d'interès a través de solucions miniaturitzades o "lab on a xip ". La visió que es persegueix en última instància al llarg d'aquest treball és la humil contribució en aquest concepte lligat a la descentralització, permetent que el camp del diagnòstic molecular es mogui fora del laboratori per a proveir informació bioanalítica in situ. La Tesi descriu l'ús d'estratègies d'amplificació amb polimerases i recombinasas en fases sòlides com a concepte híbrid que combina l'amplificació i la detecció d'ADN, la detecció de mostres reals, l'explotació dels límits de la química de superfície i de l'ADN per desenvolupar estratègies que supleixin les limitacions trobades i l'ús de "ring resonators" per monitoritzar l'evolució d'aquest mecanisme sense marcadors i en temps real.

El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es presentar un distinto enfoque y alternativa de los sensores de ADN para diseñar y fabricar un nuevo tipo de plataforma que combine la amplificación con la detección de ADN, a la vez que se superan algunas de las limitaciones existentes en el campo. Para conseguir dicho objetivo, se presentan una serie de estrategias distintas basadas en explotar nuevas estrategias de inmovilización en fase sólida y amplificación enzimática para conseguir mejores límites de detección mediante ensayos rápidos y fáciles de ejecutar. El trabajo expuesto representa un método rápido, simple y fácil de integrar a la vez que es una plataforma de biodetección que aporta nuevas ideas para la integración de los ensayos de ADN en dispositivos intervención en el sitio de interés a través de soluciones miniaturizadas o “lab on a chip”. La visión que se persigue en última instancia a lo largo de este trabajo es la humilde contribución en este concepto ligado a la descentralización, permitiendo que el campo de diagnóstico molecular se mueva fuera del laboratorio para proveer información bioanalítica in situ. La Tesis describe el uso de estrategias de amplificación con polimerasas y recombinasas en fases sólidas como concepto híbrido que combina la amplificación y la detección de ADN, la detección de muestras reales, la explotación de los límites de la química de superficie y del ADN para desarrollar estrategias que suplan las limitaciones encontradas y el uso de “ring resonators” para monitorizar la evolución de dicho mecanismo sin marcadores y en tiempo real.

The main goal of this Doctoral Thesis is to present alternative approaches in the field of DNA biosensors, designing and building new detection platforms that combine the amplification and quantification of targeted DNA while overcoming some of the current limitations. In order to achieve this objective, a variety of different strategies of effective solid-phase immobilisation strategies and isothermal enzymatic amplification have been explored to achieve lower detection limits with rapid and easy to execute assays. This work presents a convenient, rapid, simple, easy to integrate yet robust biosensing detection platform that can bring new ideas for the integration of nucleic acid tests in point of care devices through the use of lab on a chip solutions. Ultimately, the vision underlining this work is to humbly contribute to the concept of decentralisation, allowing molecular diagnostics to move away from laboratories, providing bioanalytical information in situ. The Thesis report the work performed to achieve the specific objectives of this Doctoral Thesis: the use of solid-phase recombinase polymerase amplification strategy, as a hybrid concept that combines DNA amplification and detection, the detection of real samples, the exploiting of the surface chemistry and DNA to overcome the limitations found, and the use of ring resonators for the label-free and real-time monitoring of the RPA mechanism.