Estudio de la regulación post-transcripcional de genes mediada por microRNA en pacientes con colitis ulcerosa tratados con glucocorticoides

Abstract

Antecedentes: La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad inflamatoria intestinal crónica, de etiología desconocida. Los glucocorticoides (GC) constituyen el tratamiento de elección de brotes moderados y graves de CU, pero a pesar de ello hasta un 40% presenta una respuesta inadecuada a los mismos. No se conocen con exactitud los mecanismos asociados a esta mala respuesta, y tampoco somos capaces de predecirla. El uso de moléculas como los microRNAs (miR) en la predicción de respuesta a diferentes tratamientos, es una realidad en otros campos de la medicina, pero su aplicación en la CU es aún limitada. Esta tesis pretende profundizar en el conocimiento de la refractariedad a GC sistémicos a través del estudio del transcriptoma completo (RNAm y miR) de tejido cólico de pacientes con CU. Objetivos: El objetivo principal fue confirmar la existencia de distintos perfiles en el transcriptoma de tejido cólico asociados a una respuesta inadecuada a GC sistémicos en pacientes con brotes moderados y graves de CU. Los objetivos secundarios fueron caracterizar el efecto inmediato de los GC sistémicos sobre el transcriptoma y los mecanismo de acción relacionados con la adecuada e inadecuada respuesta. Material y Métodos: Se recogieron muestras de tejido cólico de pacientes con brotes moderados y graves de CU, antes de iniciar GC sistémicos, y a los 3º días de iniciado los mismos. Los pacientes fueron clasificados en respondedores o Re (actividad leve o inactividad tras 7 días de tratamiento con GC), y no respondedores o noRe (actividad moderada o grave tras 7 días de tratamiento con GC), Además se recogieron muestras de tejido cólico de controles sanos. Las muestras obtenidas fueron estudiadas mediante secuenciación de miR (kit TruSeq Small RNA Sample de Illumina), y microarrays de genoma completo (kit Human HT-12 Expresión v4.0 BeadChip de Illumina), y los resultados de cada grupo se compararon entre si. Posteriormente se utilizaron diferentes herramientas informáticas con la intención de integrar los resultados del estudio experimental y generar un modelo teórico de respuesta al fármaco. Resultados: Se incluyeron 10 controles, y 24 pacientes con brotes moderados o graves de CU tratados con GC. De ellos 13 fueron clasificados como Re, y 11 como noRe a GC. La integridad de las muestras permitió realizar el estudio experimental en 10 pacientes de cada grupo y en 6 controles. Los resultados de la secuenciación mostraron un perfil diferencial de 2 miR antes de iniciar los GC (miR-625-3p; miR-196b-3p) entre el grupo Re y noRe. La comparación realizada entre pacientes Re antes de GC respecto a Re tras 3º días de GC mostró 6 miR diferenciales (miR-183-5p; miR-584-5p; miR-126-5p; miR-625-3p; miR-1271-5p; miR-409-5p), y un RNAm diferencial (DDIT4/REDD1). Y la comparación entre noRe antes de GC y noRe tras 3º días de GC mostró 13 miR diferenciales (miR-200c-3p; miR-18a-5p; miR-192-5p; miR-183-5p; miR-200a-5p; miR-10a-5p; miR-545-5p; miR-132-5p; miR-194-5p; miR-625-3p; miR-1271-5p; miR-409-5p; miR-504-5p). Además el estudio in silico realizado sugiere una posible asociación de la vía mTOR en la respuesta a GC. Conclusiones: En este estudio se demuestra que existe un perfil diferencial en el transcriptoma de tejido cólico de pacientes con brotes moderados o graves de CU Re y noRe a GC sistémicos antes de iniciar el tratamiento. Por otro lado, que dicho transcriptoma se modifica de forma diferente en pacientes Re y noRe en respuesta al tratamiento con GC sistémicos. Podría existir una asociación entre la regulación de la vía mTOR por miR y la respuesta a GC en la CU.

Background: Ulcerative colitis (UC) is a chronic inflammatory bowel disease of unknown etiology. Glucocorticoids (GC) remain the first-line treatment for moderate and severe active disease. However, 40% of patients do not have an appropriate response. We do not know yet the exact underlying mechanism associated with bad response and we are not able to predict it. The utility of molecules like microRNA (miRNA) in the prediction of response to treatments is a reality in other fields of medicine, for example in oncology, but little is known about the utility of these molecules in Inflammatory Bowel Disease. This thesis pretends to delve into refractoriness to GC by studying transcriptome of colonic tissue of patients with ulcerative colitis flares. Objectives: The main objective was to confirm the presence of different colonic transcriptome profiles associated to inadequate response to systemic GC in patients with moderate and severe flares of UC. Secondary objectives were to characterize the immediate effect of systemic GC treatment on the colonic transcriptome, and to determine the mechanism of action related to adequate and inadequate response. Material and Methods: Colic tissue samples of patients with moderate and severe flares of CU were collected before starting GC, and on the 3rd day of treatment. Patients were grouped in responder (less than moderate activity without need for rescue at day 7 of GC) and non-responder (moderate or severe activity at day 7 of GC). In adition, colic tissue samples from healthy controls were collected. Samples were studied by sequencing methods for miR profiles (TruSeq Small RNA Sample kit Illumina), and with microarrays (Human HT-12 kit v4.0 Expression BeadChip Illumina) for hold transcriptome study. Results of each group were compared. Subsequently bioinformatics was used to integrate results and to generate a theoretical model of response to the drug. Results: 10 controls and 24 patients with moderate or severe of UC flares treated with GC were included (13 responders and 11 non-responders to GC). The integrity of samples allowed experimental study in 10 patients of each group and 6 healthy controls. The sequencing results showed a differential miR profile (miR-625-3p, miR-196b-3p) at baseline between responders and non-responders. The comparison between responders before and after treatment show 6 differential miR (miR-183-5p, miR-584-5p, miR-126-5p, miR-625-3p, miR-1271-5p; miR -409-5p), and one differential RNAm (DDIT4 / REDD1). The comparison between non responders before and after GC treatment show 13 differential miR between groups (miR-200c-3p, miR-18a-5p; miR-192-5p, miR-183-5p, miR-200a-5p; miR 10a-5p; miR-545-5p, miR-132-5p, miR-194-5p, miR-625-3p, miR-1271-5p, miR-409-5p, miR-504-5p). In silico study suggests a possible association of the mTOR signaling pathway with the response to glucocorticoids in patients with UC flares and this pathway was used to generate 2 different models of response to GC. Conclusions: This study shows that there is a different profile in the colonic tissue transcriptome of patients with moderate or severe flares of UC responders and non-responders to systemic GC before starting treatment. This colonic transcriptome change with treatment and those changes were different in responders and non-responders. There may be an association between the regulation of the mTOR pathway by miR and the response to GC in UC.