Polycomb Repressive Complex 1 functions in differentiation and myelodysplastic syndromes

Abstract

Polycomb proteins are important epigenetic regulators involved in the maintenance of stemness and differentiation. In this thesis, I focused on the role of some Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1) components. On the one hand, I studied the role of Cbx8 PRC1 component protein in the differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs). On the other hand, I analyzed the role of PRC1 components in a hematological disease-­related context which implies a defect in differentiation, the myelodysplastic syndrome (MDS). Specifically, I focused on RING1A PRC1-­component function in this disease.

Our previous data showed that upon addition of retinoic acid (RA) during 3 days to E14 mouse ESC cell line, by which cells were prompted into the neuronal lineage, Cbx8 was upregulated both at mRNA and protein level. We performed a genome-­wide chromatin immunoprecipitation of endogenous Cbx8 coupled to direct massive parallel sequencing (ChIP-­seq) to assess the binding sites of Cbx8 genome-­ wide using IgG and Cbx8 ChIP in untreated mESC as negative controls. Our analysis identified 171 high confidence peaks. To our surprise, by crossing our data with previously published microarray analysis, we showed that several differentiation genes transiently recruit Cbx8 during their early activation. Depletion of Cbx8 by 2 different shRNA partially impaired the transcriptional activation of these genes as well as diminish Cbx8 recruitment to its target genes. Both interaction analysis, as well as chromatin immunoprecipitation experiments supported the idea that activating Cbx8 acts in the context of an intact PRC1 complex. Prolonged gene activation resulted in eviction of PRC1 despite persisting H3K27me3 and H2A ubiquitination. The composition of PRC1 is highly modular and changes when embryonic stem cells commit to differentiation. We further demonstrated that the exchange of Cbx7 for Cbx8 is required for the effective activation of differentiation genes. Taken together, our results establish a function for a Cbx8-­containing complex in facilitating the transition from a Polycomb-­ repressed chromatin state to an active state.

In order to characterize the function of PRC1 in the pathogenesis of MDS we used publicly available expression datasets of PRC1 components from MDS patients and during normal myeloid differentiation to identify and quantify the level of relevant PRC1 complexes. From this data mining we selected four PRC1 components (CBX6, BMI1, RING1A and CBX7) and two PRC2 components (EZH2 and ASXL1) for further analysis. To study these PRC components we wished to use cell lines that are MDS-­related. For this reason, we extensively characterized 5 MDS/AML derived cell lines by conventional cytogenetics, single nucleotide polymorphism arrays, mutational panel of 83 MDS/AML relevant genes and immunoprofile. After this study, we selected SKK-­1 cell line as the most suitable model to study the function of the selected PRC1 components. Based on the finding that RING1A is highly expressed in hematopoietic stem cells and further overexpressed in patients with high risk MDS, we have analyzed the role of RING1A in cells. We found that RING1A inhibits differentiation in MDS-­derived AML cells and in primary human hematopoietic stem cells (HSCs). We further provide first evidence that pharmacological inhibition of RING1A could be therapeutic strategy by showing that the treatment of HSCs favors differentiation.

Les proteïnes Polycomb són importants reguladors epigenètics implicats en el manteniment de la pluripotència i la diferenciació. En aquesta tesi, m'he centrat en el paper d'alguns components del Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1). D'una banda, he estudiat el paper de la proteïna Cbx8, component del PRC1, en la diferenciació de les cèl·lules mare embrionàries de ratolí (mESCs). D'altra banda, he analitzat el paper dels components del PRC1 en un una malaltia hematològica que implica un defecte en la diferenciació, la síndrome mielodisplàstica (SMD). En concret, m'he centrat en la funció de RING1A, component del PRC1, en aquesta malaltia. Les nostres dades anteriors van mostrar que després de l'addició d'àcid retinoic (RA) durant 3 dies a la línia cel·lular de mESCs Cbx8 es sobreexpressava, tant a nivell d'ARNm com de proteïnes. Vam realitzar una immunoprecipitació de cromatina del Cbx8 endogen a nivell de tot el genoma seguit de seqüenciació massiva (ChIP-­seq) per avaluar els punts d'unió de Cbx8 en tot el genoma utilitzant els ChIPs IgG i Cbx8 de mESC sense tractar com a controls negatius. La nostra anàlisi va identificar 171 pics d'alta confiança. Sorprenentment, en creuar les nostres dades amb l'anàlisi de microarrays publicat prèviament, es va demostrar que diversos gens de diferenciació transitòriament recluten Cbx8 durant la seva activació primerenca. El knockdown de Cbx8 per 2 shRNA diferents va afectar parcialment l'activació transcripcional d'aquests gens, així com va disminuir el reclutament de Cbx8 als seus gens diana. Tant l’anàlisi d'interacció per espectrometria de masses com els experiments de immunoprecipitació de la cromatina van donar suport a la idea que l'activació de Cbx8 actua en el context d'un complex PRC1 intacte. L’activació gènica prolongada va resultar en l’expulsió de PRC1 amb un H3K27me3 i H2AK119ub persistents. La composició del PRC1 és altament modular i canvia quan les cèl·lules mare embrionàries es diferencien. A més, vam demostrar que es requereix l'intercanvi de Cbx7 per Cbx8 per a l'activació efectiva dels gens de diferenciació. En conjunt, els nostres resultats estableixen una funció per a un complex que conté Cbx8 a l'hora de facilitar la transició d'un estat de cromatina reprimida per Polycomb a un estat actiu. Per tal de caracteritzar la funció de PRC1 en la patogènesi de SMD vam utilitzar dades d’expressió públicament disponibles de pacients amb SMD i durant la diferenciació mieloide normal per tal d’identificar i quantificar el nivell dels components de PRC1. A partir d'aquesta anàlisi es van seleccionar quatre components del PRC1 ( CBX6, BMI1, RING1A i CBX7) i dos components del PRC2 (EZH2 i ASXL1) per al seu posterior estudi. Vam decidir treballar amb línies cel·lulars relacionades amb MDS per tal d’estudiar aquests components PRC. Per aquesta raó, hem caracteritzat àmpliament 5 línies cel·lulars de leucèmia mieloide aguda (LMA) derivades de síndromes mielodisplàstiques (SMD) per citogenètica convencional, single nucleotide polymorphism arrays, un panell mutacional de 83 gens relacionats amb SMD /LMA i immunofenotip. Després d'aquest estudi, vam seleccionar la línia cel·lular SKK-­1 com el model més adequat per estudiar la funció dels components PRC1 seleccionats. Basant-­ nos en la troballa que RING1A està altament expressat en cèl·lules mare hematopoètiques i a més es sobreexpressa en pacients de SMD amb alt risc, hem analitzat la funció de RING1A. Vam trobar que RING1A inhibeix la diferenciació de la línia cel·lular de SMD/LMA i en cèl·lules mare hematopoètiques primàries. Proporcionem a més la primera evidència que la inhibició farmacològica de RING1A podria ser una estratègia terapèutica ja que el tractament en cèl·lules mare hematopoètiques afavoreix la diferenciació.