Desenvolupament de metodologia analítica per a la determinació de fàrmacs antiparasitaris

Abstract

Els fàrmacs veterinaris són utilitzats per tractar i prevenir malalties en els animals de producció, ja que és imprescindible disposar d’unes condicions salubres per als animals i així assegurar un subministrament de carn de qualitat amb garanties de seguretat. Ara bé, l’ús, que en alguns casos s’ha convertit en abús d’aquestes substàncies, ha portat a una creixent preocupació per part de la societat deguda a la possible presència d’aquests compostos en els productes d’origen animal destinats al consum humà i els possibles efectes adversos que aquests puguin provocar en la salut dels consumidors. Per aquest motiu i responent a la demanda de la població, tan la Unió Europea (per als països que hi pertanyen) com les autoritats responsables dels diferents països, han establert legislació on es fixen els límits màxims de residu (MRLs) permesos en els diferents teixits animals. Això obliga a disposar de mètodes analítics sensibles i selectius que permetin determinar aquests compostos amb garanties de seguretat. En aquest context, la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses ha esdevingut la tècnica per excel·lència per a l’anàlisi de fàrmacs veterinaris ateses la seva sensibilitat que permet la detecció de baixes concentracions de residus de matrius alimentàries i la seva capacitat de caracteritzar compostos químics i identificar substàncies desconegudes.

La present tesi s’ha centrat en el desenvolupament de metodologia analítica per a la determinació de fàrmacs veterinaris antiparasitaris, concretament els pertanyents a les famílies dels anticoccidials i les benzimidazoles en aliments i aigües. Amb l’objectiu de posar a punt mètodes altament sensibles, selectius i ràpids, els mètodes desenvolupats s’han basat majoritàriament en la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses en tàndem (MS/MS) emprant columnes cromatogràfiques de partícules de rebliment de nova tecnologia (partícules sub-2 µm i de nucli sòlid) per tal de millorar l’eficàcia i la resolució; així mateix, els tractaments de mostra aplicats s’han basat principalment en estratègies d’extracció en fase sòlida i QuEChERS per tal de minimitzar la manipulació de la mostra i el temps emprat en aquesta etapa de l’anàlisi. La fase estacionaria generalment emprada per a la separació cromatogràfica d’aquests compostos ha estat l’octadecilsilà si bé l’anàlisi d’ampròlium, un anticoccidial catiònic, ha requerit d’una fase estacionària de tipus HILIC per a la seva separació.

Alternativament es presenta un mètode basat en l’electroforesi capil·lar de zona i pre- concentració in-line de la mostra mitjançant el mètode FASI per a la determinació d’aquest mateix compost en ous. Finalment, per primer cop s’ha avaluat l’aplicabilitat d’una tècnica d’anàlisi directa, el Direct analysis in real time (DART), acoblada a l’espectrometria de masses d’alta resolució (Orbitrap) per a la determinació de coccidiostats en pinsos i benzimidazoles en llet posant de manifest que aquesta és una tècnica adequada per a la determinació d’aquests compostos, especialment les benzimidazoles, amb l’avantatge de proporcionar resultats quantitatius en qüestió de segons.

Paral·lelament a l’establiment i validació de les condicions òptimes per a cadascun dels mètodes d’anàlisi desenvolupats, aquesta tesi planteja un estudi exhaustiu del comportament dels compostos estudiats en espectrometria de masses, tan des del punt de vista de la ionització, emprant diferents fonts API compatibles amb l’acoblament a la cromatografia de líquids, com pel que fa referència a la fragmentació dels mateixos emprant diversos tipus d’analitzadors de masses. Això ha permès evidenciar que l’electrosprai és la font d’ionització més adequada per a l’anàlisi de coccidiostats, observant-se la formació d’adductes amb sodi de forma predominant en la ionització dels polièters ionòfors. Ara bé, l’anàlisi del toltrazuril i els seus metabòlits ha requerit la utilització de l’APCI ja que l’ió generat en la font d’electrosprai no és suficientment estable com per poder ser sotmès a una etapa d’espectrometria de masses en tàndem. Aquesta mateixa font, l’APCI, es proposa per a l’anàlisi de benzimidazoles per ser la única capaç d’ionitzar tota la família de compostos estudiats. Els efectes matriu han estat avaluats en tot moment i fins i tot se n’ha tret profit de l’efecte d’enhancement observat durant l’anàlisi d’ampròlium, millorant així la sensibilitat del mètode. L’establiment de les rutes de fragmentació ha permès determinar les transicions més sensibles i selectives per tal de poder ser utilitzades com a ions diagnòstic dels mètodes d’anàlisi LC-MS/MS. Així mateix, la utilització de l’espectrometria de masses d’alta resolució i relativa alta resolució mitjançant la utilització d’analitzadors de tipus Orbitrap i de triple quadrupol de quadrupols hiperbòlics respectivament, ha estat també avaluada per a la millora de la selectivitat i sensibilitat dels mètodes desenvolupats i la identificació d’estructures moleculars desconegudes.