Identification and characterization of the TRPVs protein-protein interactions, a comprehensive approach to elucidate TRPVs function and regulation

Abstract

Los canales TRPV son canales de cationes que participan en la homeostasis del calcio con propiedades de activación polimodales. Los TRPVs regulan los niveles de calcio intracelular y promueven una respuesta celular precisa a varios estímulos físico-­‐químicos, lo que permite a la célula adaptarse al entorno cambiante. La subfamilia TRPV contiene 6 miembros, clasificados en dos grupos atendiendo a su nivel de homología: TRPV1-­‐4 y TRPV5-­‐ 6. TRPV1-­‐4 son canales no selectivos de calcio que participan principalmente en termocepción, mecanocepción y la transducción del dolor. Los TRPV1-­‐4 son de un especial interés biomédico, ya que se han asociado con un amplio espectro de estados patológicos, desde distrofias musculares o neuronales a cáncer. Esta tesis tiene como objetivo ampliar el conocimiento sobre la regulación del subgrupo TRPV1-­‐4. En primer lugar, hemos recopilado la información disponible por medio de una revisión basada en TRPV2, uno de los miembros menos descritos y más interesante de la subfamilia TRPV. El análisis de la secuencia primaria y estudio de conservación de los dominios TRPV revelaron que los canales TRPV1-­‐4 comparten mecanismos básicos de funcionamiento, como el plegado y el transporte a membrana. Usando TRPV2 como punto de referencia, hemos determinado las propiedades de plegado y la topología de este canal y la importancia del dominio N-­‐terminal distal para el tráfico de TRPV2. Se les dio una atención especial a las interacciones proteína proteína, dado que los TRPV actúan dentro de las células formando complejos. Hemos mapeado la interacción con las proteínas SNARE al dominio MPD de TRPV1 y TRPV2 y el interactoma de los TRPV1-­‐4 se amplió por medio de un doble híbrido especifico de proteínas de membrana (MYTH) basado en TRPV1, TRPV2 y TRPV4.Los canales TRPV son canales de cationes que participan en la homeostasis del calcio con propiedades de activación polimodales. Los TRPVs regulan los niveles de calcio intracelular y promueven una respuesta celular precisa a varios estímulos físico-­‐químicos, lo que permite a la célula adaptarse al entorno cambiante. La subfamilia TRPV contiene 6 miembros, clasificados en dos grupos atendiendo a su nivel de homología: TRPV1-­‐4 y TRPV5-­‐ 6. TRPV1-­‐4 son canales no selectivos de calcio que participan principalmente en termocepción, mecanocepción y la transducción del dolor. Los TRPV1-­‐4 son de un especial interés biomédico, ya que se han asociado con un amplio espectro de estados patológicos, desde distrofias musculares o neuronales a cáncer. Esta tesis tiene como objetivo ampliar el conocimiento sobre la regulación del subgrupo TRPV1-­‐4. En primer lugar, hemos recopilado la información disponible por medio de una revisión basada en TRPV2, uno de los miembros menos descritos y más interesante de la subfamilia TRPV. El análisis de la secuencia primaria y estudio de conservación de los dominios TRPV revelaron que los canales TRPV1-­‐4 comparten mecanismos básicos de funcionamiento, como el plegado y el transporte a membrana. Usando TRPV2 como punto de referencia, hemos determinado las propiedades de plegado y la topología de este canal y la importancia del dominio N-­‐terminal distal para el tráfico de TRPV2. Se les dio una atención especial a las interacciones proteína proteína, dado que los TRPV actúan dentro de las células formando complejos. Hemos mapeado la interacción con las proteínas SNARE al dominio MPD de TRPV1 y TRPV2 y el interactoma de los TRPV1-­‐4 se amplió por medio de un doble híbrido especifico de proteínas de membrana (MYTH) basado en TRPV1, TRPV2 y TRPV4.

TRPV channels are cation channels involved in the calcium homeostasis with polymodal activation properties. They regulate intracellular calcium levels promoting a fine tune cellular response to several physicochemical stimuli, allowing the cell to adapt to the environmental changes. TRPV subfamily contains 6 members classified in two groups attending to their homology level: TRPV1-­‐4 and TRPV5-­‐6. TRPV1-­‐4 are non selective calcium channels mainly involved in thermoception, mechanoception and pain transduction. TRPV1-­‐ 4 members are of special biomedical interest as they have been associated with a wide spectrum of pathological conditions, from muscular or neuronal dystrophies to cancer. This thesis aims to expand the knowledge on the regulation of TRPV1-­‐4 subgroup. First, we have compiled the available information in the field by means of a review based on TRPV2, one of the least described and more intriguing members of the TRPV subfamily. Primary sequence data mining and conservation study of TRPV domains revealed that TRPV1-­‐4 channels share common basic working mechanisms as folding and trafficking. Using TRPV2 as benchmark, we have determined the folding properties and topology of this channel and the importance of the distal N-­‐terminal domain for TRPV2 trafficking. Protein protein interactions were given a special attention as TRPV channels act within the cell forming protein complexes. We have mapped the interaction with SNARE proteins within the MPD domain of TRPV1 and TRPV2 and the TRPV1-­‐4 interactome was further expanded by means of a yeast two hybrid specific for membrane proteins (MYTH) based on TRPV1, TRPV2 and TRPV4.