Aplicación de la proteómica en la búsqueda de biomarcadores de glomeruloesclerosis segmentaria y focal y nefropatía por cambios mínimos

Abstract

La nefropatía por cambios mínimos (NCM) y la glomeruloesclerosis segmentaria y focal (GSF) primaria son enfermedades glomerulares definidas por lesiones en los podocitos y las principales causas de síndrome nefrótico idiopático. Este síndrome se caracteriza por proteinuria, hipoalbuminemia, hiperlipidemia y edema, sin una etiología conocida. El diagnóstico definitivo de las enfermedades glomerulares suele requerir la realización de una biopsia renal, pero se trata de una técnica invasiva y no exenta de complicaciones. La evaluación histológica de la biopsia renal requiere el estudio mediante microscopio óptico, electrónico e inmunofluorescencia, así como una cantidad de muestra adecuada, con un número mínimo de glomérulos que permitan evidenciar el daño en los casos de lesiones focales. En ocasiones, el estudio histológico puede ser similar y no concluyente, por ejemplo, en la GSF es complicado identificar la lesión si el tejido biopsiado no contiene glomérulos afectados, y puede ser erróneamente clasificada como una NCM. Obtener el diagnóstico correcto de estas enfermedades es fundamental para poder realizar un tratamiento efectivo, ya que la NCM es típicamente sensible al tratamiento con corticoides, mientras que la GSF es generalmente resistente este tratamiento. Para evitar errores en el diagnóstico, un reto importante en nefrología es encontrar biomarcadores que permitan diferenciar entre estas dos entidades glomerulares de manera no invasiva. Durante las últimas décadas, los grandes avances tecnológicos en el campo de la proteómica han alentado la búsqueda de biomarcadores diagnósticos de numerosas enfermedades. En el caso de las enfermedades glomerulares, se han propuesto numerosos biomarcadores diagnósticos, pero son todavía muy preliminares. La mayoría de ellos se han encontrado mediante el estudio del proteoma urinario. En esta tesis, se utilizaron dos enfoques proteómicos diferentes para analizar tanto el peptidoma como el proteoma urinario de pacientes diagnosticados de NCM y GSF. El peptidoma se analizó mediante el uso de esferas magnéticas seguido de un análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF, mientras que el análisis del proteoma se llevó a cabo mediante 2D-DIGE y espectrometría de masas MALDI-TOF. Como resultado, se identificaron algunas proteínas como posibles biomarcadores candidatos capaces de diferenciar entre NCM y GSF. Uno de los candidatos fue la alfa-1-antitripsina. Esta proteína estaba aumentada en pacientes glomerulares al comparar con individuos sanos, y también permitió la diferenciación entre NCM y GSF. Mediante 2D-DIGE, varios spots identificados como alfa-1-antitripsina mostraron un mayor volumen en la NCM. Esta proteína se cuantificó por ELISA en la orina de un grupo independiente de pacientes y se observaron concentraciones más elevadas en los pacientes con NCM. Por otra parte, mediante el estudio de la peptidoma urinario, un péptido de alfa-1-antitripsina mostró diferencias entre NCM y GSF, con mayor intensidad en aquellos con NCM. Mediante el estudio del peptidoma urinario, varios péptidos de uromodulina mostraron una mayor intensidad en la población sana al comparar con pacientes glomerulares. Uno de estos péptidos permitió la diferenciación entre NCM y GSF, con mayor intensidad en la GSF. Otras proteínas, halladas mediante 2D-DIGE, también fueron propuestas como posibles candidatos en el diagnóstico diferencial de NCM y GSF: transferrina, histatina-3, proteína 39S ribosomal L17, estaban aumentados en la NCM, y calretinina, estaba aumentada en la GSF. La validación por ELISA, en la orina de un grupo independiente de pacientes, confirmó estas diferencias. Se desconoce el papel de estas proteínas en la patogenia de las enfermedades aquí estudiadas. Sin embargo, estos resultados sugieren la utilidad de estas proteínas en el diagnóstico diferencial y no invasivo de NCM y GSF. Del estudio del peptidoma resultó publicado un trabajo: Urinary peptide profiling to differentiate between minimal change disease and focal segmental glomerulosclerosis. PloS One. 2014;9(1):e87731.

Minimal change disease (MCD) and primary focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) are glomerular diseases defined by lesions of the podocyte. These diseases are main causes of idiopathic nephrotic syndrome in children and adults. This syndrome is characterized by proteinuria, hypoalbuminemia, hyperlipidemia and edema, without an underlying etiology. The final diagnosis of glomerular diseases is based on renal biopsy findings and their correlation with the clinical, laboratory and serological results. Moreover, renal biopsy is useful for determining the prognosis and for choosing the most appropriate treatment, although the invasiveness of this technique may lead to serious complications Anatomopathologic study combines conventional light microscopy, immunohistology and electron microscopy, and requires an adequate amount of tissue, with a minimum number of glomeruli to evidence the lesion. Light microscopy shows normal glomeruli in MCD and segmental scarring in some, but not all, glomeruli in FSGS. In both entities, electron microscopy typically demonstrates specific ultrastructural findings of diffuse effacement of podocytes’ foot processes in the absence of electron-dense deposits. Due to the focal nature of FSGS, it is complicated to identify this lesion if no affected glomeruli are sampled in the biopsy, and a misdiagnosis of these patients as MCD may occur. The correct diagnosis is crucial to an effective treatment, as MCD is typically responsive to steroid therapy with excellent long-term prognosis, whereas FSGS is usually resistant to steroid therapy and has progressive glomerular filtration rate loss. Consequently, the different therapy approach and the toxicity of steroids make it especially important to differentiate between these disorders. During the last decades, major technological advances in the field of proteomics have encouraged the search for diagnostic biomarkers of diseases in biological fluids. In this study, different proteomic methodologies were used to analyze the urinary peptidome and proteome of MCD and FSGS biopsy-diagnosed patients. The peptidome was analyzed by using magnetic-beads technology combined with MALDI-TOF mass spectrometry, while the proteome was analyzed by 2D-DIGE and MALDI-TOF mass spectrometry. As a result, some proteins were identified as potential candidate biomarkers able to differentiate between these glomerular diseases. One of the candidates was alpha-1-antitrypsin. This protein was increased in glomerular patients when comparing with healthy population, and also allowed differentiating between MCD and FSGS. By 2D-DIGE, several spots identified as alpha-1-antitrypsin showed a higher volume in MCD. This protein was measured by ELISA in the urine of an independent group of patients and higher concentrations were found in those with MCD. Moreover, by studying the urinary peptidome, a peptide of alpha-1-antitrypsin showed differences between MCD and FSGS, with higher intensity in those with MCD. By studying the urinary peptidome, several peptides of uromodulin showed a higher intensity in healthy population when comparing with glomerular disease patients. Moreover, one of these peptides allowed differentiating between MCD and FSGS, with higher intensity in FSGS. Other proteins, found by 2D-DIGE, were also proposed as interesting candidates for the differential diagnosis of MCD and FSGS. These proteins were: transferrin, histatin-3, 39S ribosomal protein L17, which were increased in MCD, and Calretinin, which was increased in FSGS. Validation by ELISA, in the urine of an independent group of patients, confirmed these differences. The role of these proteins in the pathogenesis of MCD and FSGS remains unknown. However, the results of this study suggest the usefulness of these proteins in the differential and non-invasive diagnosis of MCD and FSGS.

The results of the peptidome study were published: “Urinary peptide profiling to differentiate between minimal change disease and focal segmental glomerulosclerosis.” PloSOne. 2014;9(1):e87731