Estudi del paper de la proteïna quinasa CK2 en l’inici de la traducció de proteïnes i de la seva associació a microdominis de la membrana cel·lular

Abstract

La proteïna quinasa CK2 és una serina treonina quinasa que s’expressa ubiquament a la cèl·lula i de manera pleiotròpica en humans, és constitutivament activa i se n’han descrit més d’un centenar de substrats. En aquest treball hem estudiat el paper que juga aquesta proteïna en dos entorns diferents: en la regulació de l’inici del procés de traducció en el marc de la síntesi proteica i en el paper que juga quan apareix associada a microdominis de membrana i, més concretament a, lipid raft. CK2 presenta diversos substrats en tot l’entramat de proteïnes que conformen el Multifactor Complex, un compendi de proteïnes responsables dels primers passos de la de la síntesi proteica, i en aquest treball ens hem centrat en eIF2 i eIF3, on algunes de les seves subunitats són substrats de la quinasa. Després de plantejar-nos dues aproximacions, la farmacològica amb un dels inhibidor canònics de CK2 com és TBB (4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazole), i la genètica, alterant els patrons d’expressió de les subunitats de CK2 es va arribar a la conclusió que la fosforilació d’eIF2β en la seva Ser2 era clau per mantenir l’estabilitat del complex de preiniciació de la síntesi proteica. L’absència de la fosforilació provocava el desassamblatge dels complexos de preiniciació, que es traduïa amb una menor formació del ribosoma actiu, amb la conseqüent disminució de la síntesi proteica. En la segona part d’aquest treball es va aportar llum sobre un nou paper de CK2, en aquest cas, quan apareixia associada a microdominis de membrana, tant en sinaptosomes de rata com en cèl·lules humanes de ronyó HK-2. Aquests microdominis, i en concret els lipid raft, són estructures lipídiques riques en colesterol i esfingolípids, i s’han descrit com a grans plataformes de senyalització cel·lular. L’eliminació del colesterol amb metil-β-ciclodextrina (MCD) de les nostres membranes provocava el desancoratge i la pèrdua d’activitat de CK2 en aquests microdominis i això ens va portar a intentar entendre’n la raó fisiològica i estructural de la seva associació. Com que està descrit en la bibliografia que la Ser14 de Sintaxina-1 és substrat de CK2, vam centrar els nostres estudis en veure quin paper podia tenir en el cas dels sinaptosomes de rata. La Sintaxina-1 forma part del complex SNARE responsable de regular la fusió de les vesícules exocitòtiques amb la membrana presinàptica i vàrem poder comprovar que la inhibició de CK2 amb DMAT (2-dimethylamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazole) provocava una desregulació a l’alça de la secreció de glutamat. Per tant, semblava evident que la presència de CK2 en lipid raft de sinaptosomes de rata té, com a mínim, la funció de regular l’exocitosi cel·lular. L’estudi de la presència de CK2 en lipid raft de les cèl·lules renals HK-2 va demostrar que també vam ser capaços de detectar CK2 activa a la fracció corresponent als lipid raft, i es va començar a caracteritzar la resposta cel·lular als tractaments amb MCD com a treball previ per estudiar la possible relació de CK2 i la via de MAPK, on la quinasa hi té diversos substrats. Tot i quedar lluny dels objectius marcats, va posar les bases tècniques i els primers indicis experimentals per poder-ne descriure la seva funció fisiològica en un futur.

The protein kinase CK2 is a serine threonine kinase that is expressed ubiquitously along the cell and in pleiotropic manner in humans, it is constitutively active and more than one hundred substrates has been described. In this work, we have studied the role of this protein in two different situations: such as the regulation of translation initiation process in the context of protein synthesis and its role when it appears associated with membrane microdomains, more specifically the lipid raft. CK2 has some different substrates across the protein network that form the Multifactor Complex, a collection of proteins that are responsible of the first steps of protein synthesis, and in this work we have focused on eIF2 and eIF3, where some of their subunits are kinase substrates. After considering two approximations, a pharmacological one using a canonical CK2 inhibitor as it is TBB (4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzotriazole) and the genetic one altering the expression pattern of the CK2 subunits, we concluded that the phosphorylation of eIF2β on its Ser2 is necessary in order to maintain the stability of protein synthesis pre-initiation complexes. The absence of phosphorylation caused disassembly of the pre-initiation complexes that caused a decrease in the formation of active ribosome, with the consequent reduction in the protein synthesis rates. In the second part of this study we shed light on the new role for CK2, in this case, when it appears associated to membrane microdomains, in rat synaptosomes or human kidney cell called HK-2. These microdomains, and more specifically the lipid raft, are structures rich in cholesterol and sphingolipids, and they have been described as large signalling platforms. The depletion of membrane cholesterol using methyl-β-cyclodextrin (MCD) caused a CK2 detachment and a loss of its activity on these microdomains, which led us to try to understand the physiological and structural reason for this association. The literature tells that Syntaxin-1 is a CK2 substrate on its Ser14 and we focused our studies on discovering its role on rat synaptosomes. Syntaxin-1 is part of SNARE complex which regulates the fusion of the exocytotic vesicles, and we saw that the CK2 inhibition with DMAT (2-dimethylamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazole) caused an up-regulation of glutamate release. It seemed obvious that the presence of lipid raft of CK2 in rat synaptosomes has, at least, the function of regulating cell exocytosis