In vitro studies on the biological effects of cerium oxide nanoparticles

Abstract

Los rápidos avances en nanotecnología prometen ser de gran beneficio en muchas aplicaciones. A pesar de que se prevén buenas perspectivas para su futuro, existe una creciente preocupación de que la exposición humana a algunas nanopartículas (NPs) pueda dar lugar a efectos adversos para la salud. Entre los nanomateriales (NMs) ampliamente utilizados, las NPs de óxido de cerio (nanocerio) han experimentado un rápido aumento en su producción debido a sus aplicaciones industriales. Además, el nanocerio se ha presentado como un catalizador para aplicaciones biológicas. De este modo, este NM ha surgido como un agente terapéutico prometedor, eliminando especies reactivas de oxígeno (ROS), por lo que su uso se propone en diversas enfermedades originadas como consecuencia del estrés oxidativo. Debido al potencial de este NM y la falta de información sobre algunos aspectos toxicológicos, en esta Tesis se ha hecho una evaluación in vitro sobre los efectos biológicos del nanocerio. En el primer estudio se confirmó la capacidad del nanocerio para reducir los efectos oxidativos generados por un compuesto oxidante en el modelo pulmonar BEAS-2B. Así, el pretratamiento con nanocerio redujo significativamente la producción de ROS, los niveles de daño oxidativo del DNA, la muerte celular y los niveles de expresión de algunos genes implicados en la vía Nrf2. En el segundo estudio, se evaluaron las implicaciones del nanocerio en el tratamiento del cáncer. Suponiendo que las propiedades antioxidantes pudiesen ser moduladas por el pH, y dado que las células tumorales presentan un medio más ácido, el nanocerio podría tener un efecto oxidante en estas células, mientras que mantendría sus propiedades antioxidantes en un ambiente no tumoral. Sin embargo, nuestros resultados no confirmaron esta hipótesis ya que no observamos un cambio en las propiedades antioxidantes del nanocerio en las líneas y condiciones tumorales analizadas. Hasta la fecha, existe controversia con respecto a los efectos toxicológicos de este NM ya que se han descrito efectos nocivos en líneas tanto tumorales como no tumorales, y en modelos in vitro e in vivo. A fin de superar las limitaciones de los ensayos a corto plazo, en nuestro tercer estudio llevamos a cabo un tratamiento de larga duración para el estudio de las propiedades del nanocerio. Para este estudio se evaluó el potencial toxicológico y carcinogénico de la exposición in vitro a largo plazo de nanocerio en el modelo BEAS-2B, junto con los efectos asociados a una coexposición de tabaco (CSC). Así, aunque el nanocerio no indujo la transformación celular por sí mismo, tuvo un papel sinérgico en la capacidad de transformación del CSC, ya que las células co-expuestas a nanocerio más CSC, mostraron mayores efectos en todas las características carcinogénicas estudiadas. Por lo tanto, a pesar de las propiedades antioxidantes que se identificaron en los 2 estudios anteriores, el nanocerio no puede considerarse seguro, ya que puede aumentar el potencial oncogénico de otros agentes ambientales comunes. En el cuarto estudio, presentamos una solución para las limitaciones asociadas a los procedimientos de dispersión de NPs. La dispersión de NPs, necesaria para su preparación, es una fuente de variabilidad en las propiedades fisicoquímicas. Esto afecta a la fiabilidad de los experimentos de largo plazo donde se requieren varias rondas de dispersiones. Con el fin de reducir esta variabilidad, se propone alicuotar y congelar los stocks de las dispersiones de NMs. En este estudio se verificó si las propiedades fisicoquímicas y los efectos biológicos entre las dispersiones recién preparadas y congeladas difieren y, por tanto, si la congelación de las NPs afectaría a la fiabilidad. Los resultados mostraron que no había diferencias entre los preparados frescos y congelados. Por lo tanto, concluimos que el congelado de la dispersión de NPs es una técnica en la cual se ahorra tiempo y se mantiene la fiabilidad en experimentos a largo.

Rapid advances in nanotechnology promise to be of great benefit for many applications. Despite the fact that good perspectives are predicted for the future of nanotechnology, there is increasing concern that human exposure to some engineered nanoparticles (NPs) may lead to significant adverse health effects. Among the nanomaterials (NMs) extensively used, cerium oxide NPs (nanoceria) has experienced a rapid increase in production due to its novel industrial applications. More recently, nanoceria has been presented as a unique redox catalyst also for biological applications. Thus, nanoceria has emerged as a promising therapeutic agent, catalyzing reactive oxygen species (ROS)-detoxifying reactions, to be used in various diseases originated by oxidative stress. Due to the potential of this NM and the lack of information regarding some toxicological aspects, in this Thesis extended in vitro studies on the biological effects of nanoceria have been performed. From our first study we confirmed the ability of nanoceria to reduce the oxidative effects generated by a well-known oxidative compound in the epithelial BEAS-2B lung cell model. In our findings, nanoceria pre-treatment significantly reduced intracellular production of ROS, levels of DNA oxidative damage, cell death and the expression levels of some genes involved in the oxidative Nrf2 pathway. For our second trial, we studied possible implications of nanoceria in cancer treatment. We made the assumption that the antioxidant properties that we found in our first study could be modulated by pH, and that given that tumoral cells are known to have a more acidic environment, nanoceria could have a pro-oxidative effect in these cells, while keeping its antioxidant properties in non-tumoral environment. However, our results could not confirm our hypothesis as we did not observe a change in the antioxidant properties of nanoceria in the tested tumoral cell lines and environments. To date, controversy exists regarding the toxicological effects of this NM since harmful effects have been described in cancer and non-cancer cell lines, and in in vitro and in vivo models. Therefore, in our third study we attempted to overcome the limitations from short term trials in studying the properties of nanoceria by introducing a long-term treatment study. For this study we evaluate the toxicological and carcinogenic potential of in vitro long-term low-dose exposure of nanoceria in lung epithelial BEAS-2B cells, along with the effects associated to a common tobacco (CSC) co-exposure. We found that although nanoceria did not induce cell transformation on its own, it had a synergistic role on CSC transforming ability, as cells co-exposed to nanoceria-plus-CSC, showed more noticeable effects on all the hallmarks of cancer studied. Therefore, despite the antioxidant properties that were identified in the previous two studies, based on the results from this third study, nanoceria cannot be considered safe as it may increase the oncogenic potential of other common environmental agents. In our fourth and last study we presented a solution for the limitations associated to NP dispersion procedures in the field of nanotoxicology. Energetic dispersions are a source of variability in physico-chemical properties of NPs between samples, potentially affecting the reliability of long-term experiments where several rounds of dispersions are required. In order to reduce this variability, we proposed to aliquot and freeze NM stock dispersions. In this study we tested whether the physico-chemical properties and biological effects between fresh-prepared and frozen dispersions differed, and therefore whether freezing NP storage would affect reliability. In our results, we found that there were no differences between fresh and frozen preparations. Therefore, we concluded that freezing NP storage is a technique that is convenient by saving time and maintaining reliability in long-term experiments.