Estudio funcional de Ypi1, una subunidad reguladora esencial de la proteína fosfatasa Glc7

Abstract

La fosfo-desfosforilació de residus serina, treonina y tirosina és un dels mecanismes de regulació de proteïnes més estès en els éssers vius. Aquest tipus de reaccions és dut a terme d'una manera estrictament coordinada per les proteïnes quinases i fosfatases. El genoma del llevat Saccharomyces cerevisiae codifica un nombre més elevat de Ser/Thr quinases que de fosfatases. Per dur a terme la seva funció biològica, algunes Ser/Thr fosfatases han desenvolupat una estratègia evolutiva basada en la unió a subunitats reguladores, que determinen la seva localització subcel·lular, activitat i/o especificitat de substrat. Una de les Ser/Thr més estudiades en els últims anys és la fosfatasa de tipus 1 (PP1). Aquesta proteïna, molt conservada evolutivament, és essencial i està involucrada en multitud de processos biològics diferents, des del metabolisme de carbohidrats fins a la regulació del cicle cel·lular. Tant l'absència com l'excés d'activitat PP1 són perjudicials per a la cèl·lula, motiu pel qual aquesta proteïna presenta una regulació extremadament fina, presentant una multitud de subunitats reguladores que s'encarreguen de modular la seva activitat. L'estudi de la unió entre diferents subunitats reguladores i la fosfatasa han permès aprofundir en el coneixement de la regulació de la fosfatasa PP1. A més, han permès identificar, entre unes altres, una zona present en moltes d'aquestes subunitats reguladores, denominat motiu *RVxF, que és necessari per a la unió amb la fosfatasa i que interacciona amb una regió hidrofòbica de PP1 situada lluny del centre catalític de l'enzim. El genoma del llevat S. cerevisiae conté únicament un gen, denominat GLC7, que codifica l'única isoforma catalítica de la PP1 en aquest organisme. Al moment d'iniciar aquest treball el nostre grup de recerca en col·laboració amb el laboratori del Dr. Pascual Sanz (IBV, CSIC, València) acabava de caracteritzar al primer inhibidor endogen de la proteïna fosfatasa Glc7, denominant-la Ypi1 (Yeast phosphatase inhibitor-1). Aquest estudi va demostrar que aquesta proteïna interactua físicament amb Glc7 in vivo i és capaç d'inhibir la seva activitat fosfatasa in vitro. La delecció de YPI1 és letal, la qual cosa indica un paper important en la biologia cel·lular. Per això ens plantegem estudiar els efectes fenotípics atribuïbles a un increment de la seva expressió, així com la creació de mutants condicionals (basats tant en l'ús d'un degrón com en sistemes d'expressió del promotor tetO regulable per doxiciclina) amb la finalitat d'elucidar el mecanisme pel qual Ypi1 estaria regulant algunes de les funcions essencials de Glc7. Així, observem que les cèl·lules que sobreexpresan YPI1 exhibeixen un fenotip consistent amb tolerància salina, probablement a través de la regulació de la ATPasa de sodi ENA1. A més, la disponibilitat d'aquests mutants condicionals de ypi1 ha permès demostrar que la funció que aquest regulador exerceix sobre la fosfatasa Glc7 està vinculada amb el manteniment de la integritat de la paret cel·lular. D'altra banda, la falta de Ypi1 resulta en un dramàtic bloqueig en la transició G2/M del cicle cel·lular, amb gemmes anormalment allargades, i spindles mitòtics curts, encara que les bases moleculars d'aquests fenotips no han estat esclarides per complet. Els nostres resultats recents mostren que l'absència de Ypi1 provoca una estabilització de la securina Pds1, suggerint una activació dels checkpoints que regulen la transició G2/M. El bloqueig en G2/M, provocat per la falta de Ypi1 encara persisteix en cèl·lules freturoses de MAD1/MAD2 o RAD9, a pesar que aquestes cèl·lules manquen de components clau en la senyalització dels checkpoints del spindle i de dany en el DNA, respectivament. En contrast, la delecció de SWE1, que codifica una proteïna quinasa necessària per a l'activació del checkpoint de la morfogènesis, permet la sortida del bloqueig en G2/M del mutant ypi1 i recupera la morfologia normal de les cèl·lules, encara que aquestes no són capaces de sobreviure. L'absència de Ypi1 provoca una estabilització de Swe1, que comporta una persistent fosforilació de la proteïna quinasa Cdc28 en la Tyr19, inhibint la seva activitat i bloquejant la progressió del cicle cel·lular. Aquesta seqüència d'esdeveniments són els responsables d'induir una activació del checkpoint de la morfogènesis. A més, hem observat que l'absència de Ypi1 provoca un assemblatge defectuós de l'anell de septines en el coll de la gemma, podent ser aquesta la causa del bloqueig característic en G2/M descrit en aquestes cèl·lules. Finalment, no es descarta la possibilitat que la falta de Ypi1 podria involucrar l'activació de chekpoints addicionals, ja que l'estabilització de la securina Pds1 encara s'observa en cèl·lules tetO7:YPI1 swe1, a pesar que aquestes progressen a través de la mitosi. D'altra banda, la falta de Ypi1 provoca una forta disminució en l'expressió de CDC26, que codifica una subunitat del APC/C. Cèl·lules amb manca de CDC26 sofreixen un bloqueig en G2/M, amb spindles anormalment curts, fenotip idèntic a l'observat en absència de YPI1. La sobreexpresió de CDC26 permet que cèl·lules amb manca de Ypi1 progressin a través de la mitosi, encara que no corregeix el fenotip de letalitat, deixant oberta la possibilitat que Ypi1 podria modular la funció de Glc7 sobre el APC.

La fosfo-defosforilación de residuos serina, treonina y tirosina es uno de los mecanismos de regulación de proteínas más extendido en los seres vivos. Este tipo de reacciones es llevado a cabo de una manera estrictamente coordinada por las proteínas quinasas y fosfatasas. El genoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae codifica un número más elevado de Ser/Thr quinasas que de fosfatasas. Para llevar a cabo su función biológica, algunas Ser/Thr fosfatasas han desarrollado una estrategia evolutiva basada en la unión a subunidades reguladoras, que determinan su localización subcelular, actividad y/o especificidad de sustrato. Una de las Ser/Thr más estudiadas en los últimos años es la fosfatasa de tipo 1 (PP1). Esta proteína, muy conservada evolutivamente, es esencial y está involucrada en multitud de procesos biológicos diferentes, desde el metabolismo de carbohidratos hasta la regulación del ciclo celular. Tanto la ausencia como el exceso de actividad PP1 son perjudiciales para la célula, motivo por el cual esta proteína presenta una regulación extremadamente fina, presentando una multitud de subunidades reguladoras que se encargan de modular su actividad. El estudio de la unión entre diferentes subunidades reguladoras y la fosfatasa han permitido profundizar en el conocimiento de la regulación de la fosfatasa PP1. Además, han permitido identificar, entre otras, una zona presente en muchas de estas subunidades reguladoras, denominado motivo RVxF, que es necesario para la unión con la fosfatasa y que interacciona con una región hidrofóbica de PP1 situada lejos del centro catalítico de la enzima. El genoma de la levadura S. cerevisiae contiene únicamente un gen, denominado GLC7, que codifica la única isoforma catalítica de la PP1 en éste organismo. En el momento de iniciar este trabajo nuestro grupo de investigación en colaboración con el laboratorio del Dr. Pascual Sanz (IBV, CSIC, Valencia) acababa de caracterizar al primer inhibidor endógeno de la proteína fosfatasa Glc7, denominándola Ypi1 (Yeast phosphatase inhibitor-1). Este estudio demostró que esta proteína interactúa físicamente con Glc7 in vivo y es capaz de inhibir su actividad fosfatasa in vitro. La delección de YPI1 es letal, lo que indica un papel importante en la biología celular. Por ello nos planteamos estudiar los efectos fenotípicos atribuibles a un incremento de su expresión, así como la creación de mutantes condicionales (basados tanto en el uso de un degrón como en sistemas de expresión del promotor tetO regulable por doxiciclina) con el fin de elucidar el mecanismo por el cual Ypi1 estaría regulando algunas de las funciones esenciales de Glc7. Así, observamos que las células que sobreexpresan YPI1 exhiben un fenotipo consistente con tolerancia salina, probablemente a través de la regulación de la ATPasa de sodio ENA1. Además, la disponibilidad de estos mutantes condicionales de ypi1 ha permitido demostrar que la función que este regulador desempeña sobre la fosfatasa Glc7 está vinculada con el mantenimiento de la integridad de la pared celular. Por otro lado, la falta de Ypi1 resulta en un dramático bloqueo en la transición G2/M del ciclo celular, con gemas anormalmente alargadas, y spindles mitóticos cortos, aunque las bases moleculares de estos fenotipos no han sido esclarecidas por completo. Nuestros resultados recientes muestran que la ausencia de Ypi1 provoca una estabilización de la securina Pds1, sugiriendo una activación de los checkpoints que regulan la transición G2/M. El bloqueo en G2/M, provocado por la falta de Ypi1 aún persiste en células carentes de MAD1/MAD2 o RAD9, a pesar de que estas células carecen de componentes clave en la señalización de los checkpoints del spindle y de daño en el DNA, respectivamente. En contraste, la delección de SWE1, que codifica una proteína quinasa necesaria para la activación del checkpoint de la morfogénesis, permite la salida del bloqueo en G2/M del mutante ypi1 y recupera la morfología normal de las células, aunque éstas no son capaces de sobrevivir. La ausencia de Ypi1 provoca una estabilización de Swe1, que conlleva una persistente fosforilación de la proteína quinasa Cdc28 en la Tyr19, inhibiendo su actividad y bloqueando la progresión del ciclo celular. Esta secuencia de eventos son los responsables de inducir una activación del checkpoint de la morfogénesis. Además, hemos observado que la ausencia de Ypi1 provoca un ensamblaje defectuoso del anillo de septinas en el cuello de la gema, pudiendo ser ésta la causa del bloqueo característico en G2/M descrito en estas células. Finalmente, no se descarta la posibilidad de que la falta de Ypi1 podría involucrar la activación de chekpoints adicionales, ya que la estabilización de la securina Pds1 aún se observa en células tetO7:YPI1 swe1, a pesar que éstas progresan a través de la mitosis. Por otro lado, la falta de Ypi1 provoca una fuerte disminución en la expresión de CDC26, que codifica una subunidad del APC/C. Células carentes de CDC26 sufren un bloqueo en G2/M, con spindles anormalmente cortos, fenotipo idéntico al observado en ausencia de YPI1. La sobreexpresión de CDC26 permite que células carentes de Ypi1 progresen a través de la mitosis, aunque no corrige el fenotipo de letalidad, dejando abierta la posibilidad que Ypi1 podría modular la función de Glc7 sobre el APC.

Phospho/dephosphorilation in serine, threonine and tyrosine residues is one of the most widely mechanisms of protein regulation in higher organisms. These processes are strictly coordinated by protein kinases and phosphatases. The yeast Saccharomyces cerevisiae genome encodes more Ser/Thr kinases than phosphatases. To perform its biological function, some Ser/Thr phosphatases have developed an evolutionary strategy based on binding to regulatory subunits that determine Ser/Thr phosphatases subcellular localization, activity and/or substrate specificity. The most studied Ser/Thr phosphatase over years is the protein phosphatase type 1 (PP1). This protein is highly conserved evolutionarily; it is essential and is involved in many different biological processes, including carbohydrate metabolism, ion homeostasis and cell cycle regulation. Both, the absence and the excess of PP1 activity are detrimental to the cell; for this reason, have an extremely fine regulation and depend on binding to multitude of regulatory subunits which modulate PP1 activity. The connection study between different regulatory subunits and phosphatase has allowed understanding in depth the PP1 phosphatase regulation. Furthermore, many of these regulatory subunits have a conserved binding site, with a RVxF consensus sequence, which is necessary for an interaction with an hydrophobic groove in the PP1 molecule. The yeast S. cerevisiae genome contains just one gene, called essential gene GLC7, encoding the unique catalytic isoform of PP1 in this organism. At the time of starting this work, our research group in collaboration with the laboratory of Dr. Pascual Sanz (IBV, CSIC, Spain) had characterized the first endogenous inhibitor of protein phosphatase Glc7, named Ypi1 (Yeast phosphatase inhibitor-1). This study showed that this protein physically interacts with Glc7 in vivo and can inhibit the phosphatase activity in vitro. YPI1 deletion is lethal, indicating an important role in cell biology. Therefore we aimed to study the characterization of this gene product in order to elucidate the Ypi1 mechanism which would regulate some of the essential functions of Glc7. Due to essential nature of Ypi1, we performed a number of experiments by overexpressing the protein under different circumstances and the construction a strain carrying a conditional allele of YPI1 in which the protein was expressed from a regulatable degron and tetO promoter. We noticed that cells overexpressing YPI1 showed increase tolerance to alkali cations, probably through the ENA1 cation ATPase. Furthermore, the availability of these ypi1 conditional mutants has allowed to demonstrating that Ypi1 function on Glc7 is linked to the maintenance of the wall integrity cell. Moreover, the lack of Ypi1 causes a blockage in G2/M cell cycle characterized by abnormally elongated buds and short mitotic spindles; although the molecular basis of these phenotypes have not been clarified completely. Our recent results show that absence of Ypi1 induce stabilization of the levels of securing Pds1, suggesting a possible G2/M checkpoint activation. Arrest in G2/M transition, caused by lack of Ypi1 persists in cells lacking MAD1/MAD2 or RAD9, indicates that the cell cycle blockage derived from loss of Ypi1 function is not likely due the activation of the spindle or DNA damage checkpoints, respectively. In contrast, deletion of SWE1, which encodes a protein kinase required for morphogenesis checkpoint activation, allows to release the G2/M blockage of the ypi1 mutant and recover normal cell morphology, although cell are unable to survive. For instance, we observe that during the G2/M blockage in the ypi1 mutant, levels of Swe1 do not decline and, consequently, the protein accumulates, probably in a phosphorylated form. Stability of Swe1 is critical to regulate its activity towards Cdc28 protein kinase. The persistent phosphorylation of cdc28 keeps inactive the Cdk and halts the progression in the cell cycle. These dates are compatible with a scenario in which lack of Ypi1 promotes the activation of the morphogenesis checkpoint. In addition, we have observed that the absence of Ypi1 affects stability of Cdc11 and interferes with normal septin ring assembly in a Swe1-dependenet manner. Finally, there is a possibility that the lack of Ypi1 may involve activation of additional checkpoints, considering that stabilization of the levels of securing Pds1 is still observed in tetO7:YPI1 swe1 cells, even though cells progress through mitosis. Moreover, the lack of Ypi1 causes a strong decrease in the expression of CDC26, encoding a subunit of the APC/C. Cells lacking CDC26 suffer a blockage in G2/M, characterized by abnormally and short spindles, identical to phenotype observed in the absence of Ypi1. Overexpression of CDC26 allows Ypi1 deficient cells progress through mitosis, but not correct the lethality phenotype, leaving open the possibility that Ypi1 could modulate the function of Glc7 on APC