Estudi transcripcional i funcional de les ribonucleotidil reductases de Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Les ribonucleotidil reductases (RNR) són metal·loenzims essencials per la vida que catalitzen la reducció dels ribonucleòtids (NTPs) a desoxiribonucleòtids (dNTPs), per tant, les RNRs són enzims necessaris per a l’obtenció dels precursors de la síntesi i reparació de l’ADN. Fins ara, s’han descrit tres classes de RNR que realitzen la mateixa reacció; la classe I (Ia, Ib i Ic), la classe II i la classe III. Totes tres classes de RNR tenen una estructura i una regulació al·lostèrica molt semblant, encara que els seus mecanismes d’activació o generació del radical són molt diferents. Els organismes eucariotes presenten un sol tipus de RNR, la classe Ia, però els bacteris codifiquen en el seu genoma per qualsevol classe de RNR, inclús, més d’una classe per tal de ser més flexibles i sobreviure en diferents condicions ambientals. Per exemple, el genoma del bacteri Pseudomonas aeruginosa codifica; la RNR de classe Ia (funcional en condicions aeròbiques), la classe II (funcional independentment de l’oxigen però depenent de la vitamina B12) i la classe III (funcional en condicions anaeròbiques estrictes). L’estudi de la regulació transcripcional d’aquest enzim serà clau per determinar l’expressió de cada classe de RNR en diferents condicions de creixement i doncs, evitar l’expressió o activitat d’aquests enzims i poder inhibir la divisió cel·lular.

El principal factor transcripcional que regula la transcripció de les diferents RNRs és NrdR, tot i així, fins ara no s’havia estudiat aquest factor de transcripció en un microorganisme que codifiqui en el mateix genoma per a les tres classes de RNR, com és P. aeruginosa. En aquesta tesi s’ha estudiat tant el factor de transcripció NrdR com altres factors de transcripció reguladors dels gens nrd en condicions d’anaerobiosi, biofilm o d’infecció.

Els resultats obtinguts mostren la inhibició de totes tres classes de RNR a través de NrdR regulant els nivells d’expressió de cada gen en diferents condicions ambientals. A més, s’ha vist que NrdR pot regular altres gens diferents de nrd, com ara topA. S’ha estudiat un altre factor de transcripció, l’AlgR, el qual regula gens de la síntesi d’alginat i que participen en la virulència de P. aeruginosa. S’ha vist que l’AlgR indueix els gens de les RNRs de classe Ia i II en condicions d’estrès cel·lular i durant el procés de formació de biofilm. A més, s’ha vist que les RNRs de classe II i III són importants per la formació d’un biofilm madur on l’oxigen és limitant. A més, les RNRs de classe II i III s’indueixen en condicions anaeròbies i en biofilm via el factor de transcripció Dnr. Sorprenentment, també s’ha observat que la soca P. aeruginosa PAO1 expressa menys el gen de la RNR de classe III que les soques de P. aeruginosa aïllades de pacients clínics, afectant el creixement anaeròbic i a la infecció de P. aeruginosa PAO1. Per tant, s’ha vist que la RNR de classe III és important per sintetitzar dNTP durant el procés de divisió cel·lular en una infecció. Per últim, s’han estudiat les condicions de síntesi de la vitamina B12 a P. aeruginosa. S’ha vist que la síntesi de la vitamina B12 a P. aeruginosa es troba induïda en condicions aeròbiques i durant el creixement en forma de biofilm, moment on la RNR de classe II és activa.

Aquests resultats han aportat informació per entendre la reducció de ribonucleòtids a P. aeruginosa i doncs la divisió cel·lular d’aquesta, per tal de dissenyar, en un futur, una possible diana antimicrobiana.

Ribonucleotide reductase (RNR) is an essential enzyme found in all life domains. The RNR catalyses the reduction of ribonucleotides to their corresponding deoxyribonucleotides (dNTP). These enzymes are involved in de novo synthesis of dNTPs, necessary for DNA synthesis and repair, so the balance of the different dNTP has to be carefully regulated. Therefore, RNR could be a target of antiviral, antibacterial and anti-cancer therapies. All known RNRs can be divided into three classes (I, II and III). Their differences are based on structure, metallocofactor requirements, and mechanisms used for radical generation. Interestingly, Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen, is one of a few organisms that encodes in its genome three different classes (Ia, II and III) of the enzyme ribonucleotide reductase (RNR). Class I RNRs, encoded by the nrdA and nrdB genes, are found in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The activity of class I RNR is restricted to aerobic conditions. Class II RNRs, encoded by the nrdJ gene, use vitamin B12 in the radical generation process, and operate both under aerobic and anaerobic conditions. This class has been found in archaea, eubacteria and some lower eukaryotes. Class III RNRs, encoded by the nrdD gene, can only operate under anaerobic conditions and has been found in archaea and eubacteria.

In this work, we have identified different transcriptional factors of P. aeruginosa RNR. Particularly, we studied the NrdR in the transcriptional regulation of the different RNR genes during aerobic or anaerobic growth and its importance during infection. Furthermore we identified other transcriptional regulators important for the expression of RNR genes in anaerobic, biofilm and infection conditions (NarL, Dnr, AlgR…). Furthermore, we showed that the class II and III RNR are the most important RNR during biofilm formation. Surprisingly, we also demonstrated that P. aeruginosa PAO1 strain has difficulties to grow in anaerobic and infection conditions due to a mismatch in class III RNR promoter sequence. Finally, we demonstrated that P. aeruginosa syntheses vitamin B12 in aerobic and biofilm formation, determining the class II RNR activity.

These results get us closer to understanding the regulation of complex RNR networks in P. aeruginosa, how it adapts to environmental conditions and evolves throughout its life cycle to design an antimicrobial compound.