Cerca i identificació de nous biomarcadors de fibrosi hepàtica per mitjà de tècniques proteòmiques

Abstract

La detecció precoç de fibrosi hepàtica és de gran rellevància per al diagnòstic i el tractament dels pacients amb una malaltia hepàtica crònica. Actualment, s'utilitzen diversos procediments per a la seva estadificació. No obstant això, aquests mètodes poden comportar complicacions clíniques i/o presentar incertesa diagnòstica principalment en les primeres etapes de la malaltia. En aquest context, el primer estudi de la present tesi doctoral va ser dissenyat per revelar nous biomarcadors no invasius de fibrosi hepàtica en un model in vivo d'inducció a fibrosi i cirrosi mitjançant la inhalació crònica de CCl4. Es van analitzar 94 mostres de sèrum de rates Wistar adultes amb diferents graus de fibrosi hepàtica i 36 rates control. En primer lloc, les mostres de sèrum procedents de 18 rates tractades amb CCl4 es van agrupar en tres conjunts diferents en funció de la gravetat del dany hepàtic i el proteoma sèric es va identificar mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses en tàndem i lliure de marcatge (label-free LC-MS/MS). A més a més, es van analitzar tres mostres de sèrum obtingudes de la combinació de 16 rates Wistar control. En base a les dades proteòmiques obtingudes, es va realitzar una anàlisi multivariant que va mostrar tres principals vies de senyalització cel·lular alterades en la fibrosi. En estadis cirròtics, es van detectar més desequilibris biològics, així com alteracions multiorgàniques. De les múltiples proteïnes alterades, es va seleccionar l’hemopexina i SIPA1L1 (signal-induced proliferation-associated 1-like 1) com a potencials marcadors sèrics de fibrogènesi hepàtica. Els resultats van ser validats per ELISA en un grup independent de 76 rates fibròtiques/cirròtiques i 20 controls, que van confirmar SIPA1L1 com un potencial biomarcador no invasiu de fibrosi hepàtica. En concret, SIPA1L1 va mostrar una clara disminució en les mostres de sèrum de rates fibròtiques i cirròtiques, així com una gran precisió per identificar estadis primerencs de la malaltia. En conclusió, l'anàlisi proteòmic de mostres sèriques de rates tractades amb CCl4 ha permès la identificació de SIPA1L1 com un marcador no invasiu de fibrosi hepàtica primerenca. El segon estudi es va dissenyar per identificar nous biomarcadors no invasius de fibrosi hepàtica, en un context clínic on el procés fibrogènic es produeix de forma més accelerada: en pacients amb VHC positiu i que es van sotmetre a un trasplantament de fetge (LT). En concret, es van analitzar mostres sèriques de 93 pacients LT amb recidiva del VHC, 41 pacients fibròtics de diferents etiologies no trasplantats i amb un estadi fibròtic F≥1 i, com a grup control, 9 pacients sense recurrència del VHC que van rebre tractament antiviral abans del LT. Finalment, també es va analitzar la sang obtinguda de 16 subjectes sans. Les mostres de sèrum van ser fraccionades per cromatografia d'intercanvi iònic i el seu perfil proteòmic es va analitzar per SELDI-TOF MS. La separació del pèptid d'interès es va realitzar per cromatografia d'intercanvi iònic i electroforesi en gel, seguida de la identificació per espectrometria de masses en tàndem. Es van observar diferències marcades entre el perfil proteic sèric dels pacients LT que van presentar recurrència primerenca de fibrosi i els no recurrents (grup control). De totes elles, l'elevada intensitat que presentava el pic proteic de m/z 5.905 va ser la característica més distintiva dels pacients LT no recurrents. No obstant això, el mateix pic amb prou feines es va detectar en pacients LT recurrents. Aquestes diferències també es van observar en comparar mostres sèriques de subjectes sans amb mostres de pacients fibròtics no trasplantats, fet que indica que els resultats obtinguts no estaven relacionats amb la infecció del VHC o el trasplantament hepàtic. Mitjançant l'ús d'espectrometria de masses en tàndem, es va identificar el pic de m/z 5.905 com un fragment C-terminal de la cadena α de fibrinogen. Els experiments amb cultius cel·lulars van demostrar que TGF-β reduïa l'expressió de mRNA de la cadena α del fibrinogen així com la intensitat del pic proteic en les cèl·lules HepG2, el que suggereix que l'activitat de TGF-β regula els nivells circulants d'aquest fragment . En conclusió, es va identificar un fragment C-terminal de la cadena α del fibrinogen, de 5,9 kDa, com un biomarcador sèric precoç dels processos fibrogènics en pacients amb malaltia hepàtica.

At present, several procedures are used for staging liver fibrosis. However, these methods may involve clinical complications and/or present diagnostic uncertainty mainly in the early stages of the disease. Therefore, the first study was designed to unveil new non-invasive biomarkers of liver fibrosis in an in vivo model of fibrosis/cirrhosis induction by CCl4 inhalation. The study was performed on 94 serum samples obtained from adult Wistar rats with different degrees of fibrosis and 36 control rats. Firstly, 18 serum samples from fibrotic/cirrhotic rats were clustered into 3 different groups according to the severity of hepatic fibrosis and were injected on a LTQ Orbitrap. Three different pooled serum samples obtained from 16 control rats were also analyzed. Among all the identified and quantified proteins, haemopexin and Signal-Induced Proliferation-Associated 1 Like 1 (SIPA1L1) were selected as potential serum markers of liver fibrogenesis. The results were validated by ELISA in an independent group of 76 fibrotic/cirrhotic rats and 20 controls which confirmed SIPA1L1 as a potential non-invasive biomarker of liver fibrosis (AUROC: 0.865). In conclusion, we identified SIPA1L1 as a potential serum marker of early liver fibrosis in an experimental model of hepatic fibrosis. In the second investigation we took advantage of the faster development of hepatic fibrosis in HVC-positive liver transplant patients (LT) to identify early circulating serum biomarkers of active fibrogenesis. We analyzed 93 LT patients with HCV recurrence, 41 non-LT patients with liver disease showing a fibrosis stage F≥1 and 9 patients without HCV recurrence who received antiviral treatment before LT, as control group. Blood obtained from 16 healthy subjects was also analyzed. Serum samples were fractionated by ion exchange chromatography and the proteomic profile was analyzed by a high-throughput proteomic technique (SELDI-TOF MS). Marked differences were observed between the serum proteome profile of LT patients with early fibrosis recurrence and non-recurrent LT patients. The peak located at m/z 5,905 showed the most remarkable difference, since it was fully detected in non-recurrent LT patients but almost suppressed in recurrent LT patients. Similar results were found when comparing samples of healthy subjects with those of non-LT fibrotic patients. Using tandem mass-spectrometry, we identified the protein peak as a C-terminal fragment of the fibrinogen α chain. Finally, cell culture experiments demonstrated that TGF-β reduces α-fibrinogen mRNA expression and m/z 5,905 peak intensity in the secretome of the HepG2 cells. In summary, we identified a 5.9 kDa C-terminal fragment of the fibrinogen α chain as a serum biomarker of early fibrogenic processes in patients with liver disease.