Study of related senescence pathways in soft tissue tumors development

Abstract

Introducción: En esta tesis doctoral hemos estudiado y analizado los marcadores de senescencia celular en un subgrupo de tumores de partes blandas, los tumores de la vaina nerviosa periférica (PNSTs), neoplasias que pueden ocurrir de forma esporádica o estar asociadas a síndromes clínicos como las neurofibromatosis (NFs). La senescencia inducida por oncogenes (OIS) es un tipo específico de senescencia y es un mecanismo de detención del crecimiento celular demostrado en líneas celulares y en algunos tipos de cánceres humanos. Por esta razón se considera un proceso de supresión tumoral contra la transformación maligna de las células. Diferentes vías moleculares están involucradas en este proceso, como RAS/RAF/MAPK o ARF/p53 y p16INK4a/ pRb. Entre los PNSTs, los schwannomas representan un subgrupo de tumores benignos que sólo muy raramente se transforman a neoplasias malignas. Estos tumores, al igual que el nevus, se componen de células derivadas de la cresta neural. Mientras en el nevus está claro que el mecanismo principal que evita la transformación maligna es la entrada en senescencia, en respuesta a la activación de la vía de RAS/MAPK/RAF (mutación de BRAF V600E), poco se conoce todavía de los mecanismos involucrados en el desarrollo de los PNSTs. Los PNSTs que ocurren en las NFs están relacionados con alteraciones de dos genes específicos de estos síndromes, NF1 y NF2, capaces de activar la vía de RAS/MAPK/RAF. Sin embargo, muy poco se conoce sobre la patogénesis de los PNSTs esporádicos y sobre la transformación maligna de los schwannomas. Este estudio analiza los marcadores de senescencia en los PNSTs, con la finalidad de demostrar el posible papel de la senescencia en sus tumorigénesis, junto con la presencia o ausencia de mutaciones BRAF V600E en estos tumores, especialmente en los esporádicos.

Métodos: Se ha realizado un estudio retrospectivo de inmunohistoquímica en 39 schwannomas y 18 tumores malignos de la vaina nerviosa periférica tumores (MPNSTs), utilizando tinción para marcadores de senescencia p16INK4a, Ki67, p53 y ciclina D1 en todos los casos. Además, se analizó la actividad de la SA-β-Gal, utilizando una tinción histoquímica específica en los casos en que se disponía de tejido congelado (n = 8). Por otra parte se analizaron las mutaciones del exón 15 de BRAF y de los exones 2 y 3 del gen KRAS, a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y la secuenciación se realizó en muestras fijadas en formalina e incluidas en parafina de 59 schwannomas, 16 neurofibromas y 24 MPNSTs, de pacientes relacionados y no relacionados con las NFs.

Resultados: En los schwannomas encontramos una elevada expresión inmunohistoquímica de p16INK4a, baja o ausentes niveles de Ki67 y observamos positividad de la actividad β-SA-Gal. Un patrón opuesto se encontró en los MPNSTs. Se observaron mutaciones de BRAF V600E en 4/40 y 1/13 schwannomas MPNSTs, no asociados con NFs. En un caso de schwannoma esporádico encontramos la mutación de gen KRAS G12S.

Conclusión: Nuestros resultados apoyan la hipótesis que los schwannomas son lesiones senescentes y que en los MPNSTs este fenotipo de senescencia se pierde durante la trasformación maligna. Además, el hallazgo de mutaciones de BRAF y KRAS en un subgrupo de PNSTs no relacionadas con NFs representa un evento importante, especialmente para el desarrollo de un tratamiento específico novedoso para estos tumores.

Introduction: In this thesis we have studied and analyzed markers of cellular senescence in a subset of soft tissue tumors, peripheral nerve sheath tumors (PNSTs), neoplasms that may occur sporadically or be associated with clinical syndromes such as neurofibromatosis (NFs). Oncogenic-induced senescence (OIS) is a growth-arrest mechanism demonstrated in cells and in some type of human cancers. For this reason it is considered a tumor suppressor process against malignant transformation. Different molecular pathways are involved in this process, such as RAS/RAF/MAPK or ARF/p53 and p16INK4a/pRb. Among the PNSTs, schwannomas represent a subset of benign tumors that only very rarely undergo malignant changes. These tumors, like nevus, are composed of cells derived from the neural crest. While in the nevus is clear that the main mechanism preventing malignant transformation is the entry into senescence, in response to activation of the RAS/MAPK/RAF pathway (BRAF mutation V600E), the mechanisms involved in the development of PNSTs remain still unknown. The PNSTs occurring in NFs are related to alterations in two specific genes of these syndromes, NF1 and NF2, able to activate the RAS/MAPK/RAF pathway. However, very little is known about the pathogenesis of sporadic PNSTs and malignant transformation of schwannomas. This study analyzes the markers of senescence in PNSTs, in order to demonstrate the potential role of senescence in their tumorigenesis, along with the presence or absence of BRAF V600E mutations in these tumors, especially in sporadic ones.

Methods: A retrospective immunohistochemical study was done in 39 schwannomas and 18 malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Staining for p16INK4a, Ki67, p53 and Cyclin D1 was performed in all the cases. Additionally, SA-β-Gal staining was done in those cases in which frozen tissue was available (n=8). Moreover BRAF exon 15 and KRAS exons 2 and 3 polymerase chain reaction (PCR) sequencing was performed in formalin-fixed/paraffin-embedded samples of 59 schwannomas, 16 neurofibromas and 24 MPNSTs, related and non-related to NF types 1 and 2. Results: In schwannomas we found high expression of p16INK4a, low or absent levels of Ki67 and positivity of SA-β-Gal activity. An opposite pattern was found in MPNSTs. Oncogenic BRAF V600E mutations were observed in 4/40 schwannomas and 1/13 MPNST, not associated with NF. A KRAS G12S mutation was also evident in one sporadic schwannoma. Conclusions: Our results support the senescence nature of schwannomas and the absence of senescence phenotype in MPNSTs. Moreover the finding of BRAF V600E and KRAS mutations in a subset of PNSTs not related to NF represents an important event especially for the development of novel specific treatment for these tumors.